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생화학

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65664
, ,
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences,Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry,Federal University of Santa Maria

Summary

ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。

Abstract

パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患や、がんなどの細胞障害は、ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝を乱す疾患の一部です。ミトコンドリアは、エネルギー代謝と細胞の生存と死に関与する細胞プロセスの両方を制御する細胞小器官です。このため、ミトコンドリア機能を評価するアプローチは、病理学的および生理学的プロセスにおける細胞の状態に関する重要な洞察を提供することができます。この点で、高分解能スピロメトリー(HRR)プロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする。さらに、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学の研究には、 ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のような遺伝的および実験的に扱いやすいモデルが必要です。

このモデルには、人間の生理学との類似性、迅速なライフサイクル、メンテナンスの容易さ、費用対効果、高いスループット能力、倫理的懸念の数の最小化など、いくつかの利点があります。これらの特性は、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールとしてそれを総合的に確立します。本研究では、ショウ ジョウバエ(Drosophila melanogaster )PINK1B9欠損変異体を用いたミトコンドリア機能の解析方法について説明する。 pink1 遺伝子は、ミトコンドリアネットワークから機能不全のミトコンドリアを除去するために重要なマイトファジーとして認識されるプロセスを通じて、PTEN誘導推定キナーゼ1をコードする役割を担っています。この遺伝子の変異は、PDの常染色体劣性早期発症家族性型と関連している。このモデルは、PDの病態生理学に関与するミトコンドリア機能障害を研究するために使用できます。

Introduction

ミトコンドリアは、アポトーシス調節、カルシウム恒常性、生合成経路への参加などの重要な機能を制御する細胞小器官です。自律的な遺伝物質を持つことで、細胞の維持や修復プロセスに貢献することができます。その構造には、細胞エネルギーに不可欠な電子伝達鎖と酸化的リン酸化が収められています1,2,3。特に、酸化的リン酸化(OXPHOS)によるアデノシン三リン酸(ATP)の生成により、エネルギー制御が実現しています2。ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝の乱れは、細胞の生存と死の両方で起こり4,5、癌などの幅広いヒト病状やパーキンソン病(PD)などの神経変性疾患にしばしば関連しています3,6。

パーキンソン病は、慢性、進行性、神経障害です。この病気の主な原因は、脳細胞、特に運動を制御する神経伝達物質ドーパミンの産生に関与する黒質の死です6,7,8。パーキンソニズムとミトコンドリア機能障害を結びつけた最初の観察は、1988年に、呼吸鎖複合体Iを阻害する毒素を用いた実験モデルで行われた9。

現在、ミトコンドリアの機能不全を評価する方法はいくつかあります10,11,12,1 3;ただし、従来のアプローチと比較して、高分解能スピロメトリー(HRR)は優れた感度と利点を示します13,14。例えば、HRRプロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする14,15。ミトコンドリアの機能障害は、無傷の細胞、単離されたミトコンドリア、さらにはex vivoで評価できます10,11,13,14。

ミトコンドリアの機能障害は、多くの病理学的および生理学的プロセスと密接に関連しています。したがって、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学を、遺伝的および実験的に扱いやすいモデルシステムを用いて研究することが重要です。この点で、ショウジョウバエであるショウジョウバエの研究にはいくつかの利点があります。このモデルは、遺伝物質としてのDNAの使用、一般的な細胞小器官、発生、免疫、細胞シグナル伝達に関与する保存された分子経路など、基本的な細胞特性とプロセスをヒトと共有しています。さらに、ショウジョウバエはライフサイクルが速く、メンテナンスが容易で、低コスト、高スループット、倫理的懸念が少ないため、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールを構成しています16,17,18,19,20。

さらに、PTEN誘導推定キナーゼ1(pink1)遺伝子の相同体がD. melanogasterで発現している。これは、マイトファジー8のプロセスを通じて損傷したミトコンドリアの除去に重要な役割を果たします。ヒトでは、この遺伝子の変異により、ミトコンドリア機能障害に関連する常染色体劣性家族性PDの素因となります8,21,22,23。したがって、ショウジョウバエは、PDの病態生理学の研究や、ミトコンドリアの機能不全と生体エネルギー学に焦点を当てた医薬品候補のスクリーニングのための強力な動物モデルです。そこで本研究では、D. melanogaster由来のPDモデルにおけるミトコンドリア機能を、SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration)プロトコルを用いたオロボロスのHRR法を用いて解析する方法を解説する。

Protocol

ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(ID番号:34749)のw1118(白)およびw[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9と呼ぶ)(FlyBase ID:FBgn0029891)を用いた。本研究では、雄のD. melanogaster PINK1B9欠損変異体を、対照群(遺伝的背景)として用いたw1118株の雄のD. melanogasterと比較した。胸部の変形や移動障害など、ハエが正しい遺伝子型(…

Representative Results

ここで、PINK1B9 ヌルハエでは、OXPHOS CI(P = 0.0341)およびOXPHOS CI&II(P = 0.0392)状態のO2フラックスが減少する(図4)。この結果は、私たちのグループ29,30からの以前の調査結果でも観察されました。 CIとCIIは電子伝達系(ETS)の主要コンポーネントであり、CIはNADHからユビキノンへ?…

Discussion

HRRは、 D. melanogaster やその他の生物のミトコンドリア呼吸とエネルギー代謝を研究するための強力な技術です。ミトコンドリア機能を詳細かつ定量的に評価し、研究者が細胞の生体エネルギー学に関する洞察を得ることを可能にします。ここに示されるプロトコルはD .のmelanogasterのスーツのプロトコルを使用してミトコンドリアの呼吸鎖機能そして特定のミトコンドリア複合体?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ブラジルの機関Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)に謝意を表します。PM(#88887.512821/2020-00)とTD(#88887.512883/2020-00)は、研究フェローシップの受賞者です。

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7
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References

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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).
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