Analysere mitokondriell funksjon i en Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant ved bruk av høyoppløselig respirometri
Summary
Her presenterer vi en høyoppløselig respirometriprotokoll for å analysere bioenergetikk i PINK1B9-null mutante bananfluer. Metoden bruker protokollen Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Abstract
Neurodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), og cellulære forstyrrelser som kreft er noen av de lidelsene som forstyrrer energimetabolismen med svekkelse av mitokondrielle funksjoner. Mitokondrier er organeller som styrer både energimetabolisme og cellulære prosesser involvert i celleoverlevelse og død. Av denne grunn kan tilnærminger til evaluering av mitokondriell funksjon gi viktig innsikt i cellulære forhold i patologiske og fysiologiske prosesser. I denne forbindelse tillater protokoller med høy oppløsning respirometri (HRR) evaluering av hele mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon eller aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser. Videre krever studier av mitokondriell fysiologi og bioenergetikk genetisk og eksperimentelt håndterbare modeller som Drosophila melanogaster.
Denne modellen gir flere fordeler, for eksempel dens likhet med menneskelig fysiologi, dens raske livssyklus, enkelt vedlikehold, kostnadseffektivitet, høy gjennomstrømningskapasitet og et minimert antall etiske bekymringer. Disse egenskapene etablerer det kollektivt som et uvurderlig verktøy for å dissekere komplekse cellulære prosesser. Det foreliggende arbeidet forklarer hvordan man analyserer mitokondriell funksjon ved bruk av Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. Det rosa1 genet er ansvarlig for koding av PTEN-indusert antatt kinase 1, gjennom en prosess anerkjent som mitofagi, noe som er avgjørende for fjerning av dysfunksjonelle mitokondrier fra mitokondrienettverket. Mutasjoner i dette genet har vært assosiert med en autosomal recessiv familiær form for PD med tidlig debut. Denne modellen kan brukes til å studere mitokondriell dysfunksjon involvert i patofysiologien til PD.
Introduction
Mitokondrier er cellulære organeller som styrer viktige funksjoner, inkludert apoptotisk regulering, kalsiumhomeostase og deltakelse i biosyntetiske veier. Ved å ha autonomt genetisk materiale, er de i stand til å bidra til cellulære vedlikeholds- og reparasjonsprosesser. Deres struktur huser elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering, begge avgjørende for cellulær energi 1,2,3. Spesielt oppnås energikontroll gjennom adenosintrifosfat (ATP) produksjon via oksidativ fosforylering (OXPHOS)2. Forstyrrelse av energimetabolisme med svekkelse av mitokondrielle funksjoner forekommer både i celleoverlevelse og død 4,5, ofte forbundet med et bredt spekter av menneskelige patologier, som kreft, og nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom (PD)3,6.
PD er en kronisk, progressiv og nevrologisk lidelse. Den primære årsaken til denne sykdommen er død av hjerneceller, spesielt i substantia nigra, som er ansvarlige for produksjonen av nevrotransmitteren dopamin, som styrer bevegelse 6,7,8. Den tidligste observasjonen som knyttet parkinsonisme til mitokondriell dysfunksjon ble gjort i 1988, i eksperimentelle modeller ved bruk av toksiner som hemmer respiratorisk kjedekompleks I9.
For tiden er det flere metoder for å evaluere mitokondriell dysfunksjon 10,11,12,1 3; Imidlertid, sammenlignet med konvensjonelle tilnærminger, presenterer høyoppløselig respirometri (HRR) overlegen følsomhet og fordeler13,14. For eksempel tillater HRR-protokoller evaluering av hele mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon eller aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser 14,15. Mitokondrielle dysfunksjoner kan vurderes i intakte celler, isolerte mitokondrier, eller til og med ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondrielle dysfunksjoner er nært forbundet med mange patologiske og fysiologiske prosesser. Det er derfor viktig å studere mitokondriefysiologi og bioenergetikk ved hjelp av genetisk og eksperimentelt håndterbare modellsystemer. I denne forbindelse har forskning på Drosophila melanogaster, fruktfluen, flere fordeler. Denne modellen deler grunnleggende cellulære egenskaper og prosesser med mennesker, inkludert bruk av DNA som genetisk materiale, vanlige organeller og konserverte molekylære veier involvert i utvikling, immunitet og cellesignalering. I tillegg har bananfluer en rask livssyklus, enkelt vedlikehold, lave kostnader, høy gjennomstrømning og færre etiske bekymringer, og utgjør dermed et uvurderlig verktøy for å dissekere komplekse cellulære prosesser 16,17,18,19,20.
Videre uttrykkes en homolog av det PTEN-induserte antatte kinase 1 (rosa1)-genet i D. melanogaster. Det spiller en avgjørende rolle i fjerning av skadede mitokondrier gjennom prosessen med mitofagi8. Hos mennesker predisponerer mutasjoner i dette genet individer til en autosomal recessiv familiær form for PD assosiert med mitokondriell dysfunksjon 8,21,22,23. Bananfluen er derfor en kraftig dyremodell for studier av patofysiologien til PD og screening av legemiddelkandidater med fokus på mitokondriell dysfunksjon og bioenergetikk. Derfor forklarer dette arbeidet hvordan man analyserer mitokondriell funksjon i en modell av PD fra D. melanogaster ved hjelp av HRR-teknikken i OROBOROS med SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR er en kraftig teknikk for å studere mitokondriell respirasjon og energimetabolisme i D. melanogaster og andre organismer. Det gir en detaljert og kvantitativ vurdering av mitokondriell funksjon, slik at forskere kan få innsikt i cellens bioenergetikk. Protokollen som presenteres her beskriver evalueringen av mitokondriell respiratorisk kjedefunksjon og aktiviteten til spesifikke mitokondriekomplekser ved bruk av SUIT-protokollen i D. melanogaster. SUIT-protokollen innebærer systematisk manipuleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner det brasilianske byrået Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) og T.D. (#88887.512883/2020-00) er stipendiatmottakere.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
