Анализ митохондриальной функции у PINK1B9-нулевого мутанта Drosophila melanogaster с использованием респирометрии высокого разрешения
Summary
Здесь мы представляем протокол респирометрии высокого разрешения для анализа биоэнергетики у мутантных плодовых мушек PINK1B9-null. В методе используется протокол SUIT (субстрат-разветвитель-ингибитор-титрование).
Abstract
Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона (БП), и клеточные нарушения, такие как рак, являются одними из расстройств, которые нарушают энергетический метаболизм с нарушением функций митохондрий. Митохондрии — это органеллы, которые контролируют как энергетический обмен, так и клеточные процессы, участвующие в выживании и гибели клеток. По этой причине подходы к оценке функции митохондрий могут дать важную информацию о клеточных состояниях при патологических и физиологических процессах. В связи с этим протоколы респирометрии высокого разрешения (HRR) позволяют оценить всю функцию дыхательной цепи митохондрий или активность специфических митохондриальных комплексов. Кроме того, изучение физиологии митохондрий и биоэнергетики требует генетически и экспериментально управляемых моделей, таких как Drosophila melanogaster.
Эта модель имеет ряд преимуществ, таких как сходство с физиологией человека, быстрый жизненный цикл, простота обслуживания, экономичность, высокая пропускная способность и минимальное количество этических проблем. Эти свойства в совокупности делают его бесценным инструментом для анализа сложных клеточных процессов. В настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию с использованием мутанта Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Ген pink1 отвечает за кодирование PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 посредством процесса, известного как митофагия, который имеет решающее значение для удаления дисфункциональных митохондрий из митохондриальной сети. Мутации в этом гене были связаны с аутосомно-рецессивной ранней семейной формой болезни Паркинсона. Данная модель может быть использована для изучения митохондриальной дисфункции, участвующей в патофизиологии болезни Паркинсона.
Introduction
Митохондрии — это клеточные органеллы, которые контролируют важные функции, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и участие в биосинтетических путях. Обладая автономным генетическим материалом, они способны вносить свой вклад в процессы поддержания и восстановления клеток. В их структуре находятся цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование, которые имеют решающее значение для клеточной энергии 1,2,3. В частности, энергетический контроль достигается за счет производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS)2. Нарушение энергетического обмена с нарушением функций митохондрий происходит как при выживаемости, так и при гибели клеток 4,5, часто связанных с широким спектром патологий человека, таких как рак, и нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)3,6.
Болезнь Паркинсона является хроническим, прогрессирующим и неврологическим расстройством. Основной причиной этого заболевания является гибель клеток головного мозга, особенно черной субстанции, которые отвечают за выработку нейромедиатора дофамина, контролирующего движения 6,7,8. Самое раннее наблюдение, которое связало паркинсонизм с митохондриальной дисфункцией, было сделано в 1988 году в экспериментальных моделях с использованием токсинов, которые ингибируют дыхательную цепь Complex I9.
В настоящее время существует несколько методов оценки митохондриальной дисфункции 10,11,12,1 3; однако, по сравнению с традиционными подходами, респирометрия высокого разрешения (HRR) обладает более высокой чувствительностью и преимуществами13,14. Например, протоколы HRR позволяют оценить всю функцию митохондриальной дыхательной цепи или активность специфических митохондриальных комплексов14,15. Митохондриальные дисфункции могут быть оценены в интактных клетках, изолированных митохондриях или даже ex vivo 10,11,13,14.
Митохондриальные дисфункции тесно связаны со многими патологическими и физиологическими процессами. Поэтому важно изучать митохондриальную физиологию и биоэнергетику с использованием генетически и экспериментально управляемых модельных систем. В этом отношении исследования дрозофилы меланогастер, плодовой мушки, имеют ряд преимуществ. Эта модель разделяет фундаментальные клеточные характеристики и процессы с людьми, включая использование ДНК в качестве генетического материала, общих органелл и консервативных молекулярных путей, участвующих в развитии, иммунитете и клеточной сигнализации. Кроме того, плодовые мушки обладают быстрым жизненным циклом, простотой в уходе, низкой стоимостью, высокой пропускной способностью и меньшим количеством этических проблем, что представляет собой бесценный инструмент для препарирования сложных клеточных процессов 16,17,18,19,20.
Кроме того, гомолог гена PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 (pink1) экспрессируется у D. melanogaster. Он играет решающую роль в удалении поврежденных митохондрий в процессе митофагии8. У людей мутации в этом гене предрасполагают людей к аутосомно-рецессивной семейной форме болезни Паркинсона, связанной с митохондриальной дисфункцией 8,21,22,23. Следовательно, плодовая мушка является мощной животной моделью для исследований патофизиологии болезни Паркинсона и скрининга кандидатов в лекарственные препараты с акцентом на митохондриальную дисфункцию и биоэнергетику. Таким образом, в настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию в модели БП от D. melanogaster с использованием метода HRR в OROBOROS с протоколом Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR является мощным методом изучения митохондриального дыхания и энергетического обмена у D. melanogaster и других организмов. Он обеспечивает детальную и количественную оценку митохондриальной функции, позволяя исследователям получить представление о биоэнергетике клеток. Представле…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность бразильскому агентству Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) и T.D. (#88887.512883/2020-00) являются получателями исследовательских стипендий.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
