Summary
Follikkelstimulerende hormon (FSH) i forskjellige ekstragonadale vev og organer er forbundet med patogenesen av flere sykdommer. Den ovariektomiserte og FSH-behandlede musemodellen (OVF) kan brukes til å utforske de ekstragonadale virkningene av FSH.
Abstract
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalder) opplever mange kvinner betydelige fysiologiske og patologiske forandringer, inkludert redusert benmasse, økte blodlipider og økt visceral fett. Nivåer av follikkelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen. Mange studier har vist at FSH i forskjellige ekstragonadale vev og organer er forbundet med patogenesen av flere sykdommer. Derfor er det spesielt viktig å bygge en dyremodell som kan bidra til å studere de uavhengige effektene av FSH in vivo . I denne studien ble C57BL/6 hunnmus ovariektomert og supplert med østradiolvalerat (OVX + E2) for å eliminere effekten av hypothalamus-hypofyse-gonadalaksen. OVX + E2-musene fikk løsningsmiddel (N.S.) eller forskjellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injeksjon for å lage en musemodell (OVF) preget av relativt stabilt østrogen og stigende FSH-nivåer. Dermed genererte vi vellykket en eksperimentell musemodell for å etterligne det tidlige stadiet av overgangsalderen, preget av forhøyede serum-FSH-nivåer. OVF-modellen har fordelene ved å være stabil, lav kostnad og enkel å betjene, noe som er egnet for studier for å utforske de ekstragonadale virkningene av FSH. Her beskriver vi detaljerte protokoller for musens OVF-modell.
Introduction
Nivåene av follikkelstimulerende hormon (FSH) stiger under overgangsalderen (begrepet menopausal overgang ble definert i 2011 på stadier av reproduktiv aldring workshop (STRAW) + 10 system)1. Det er under overgangsalderen, en periode preget av stigende FSH-nivåer og relativt stabilt østrogen1, at kvinner opplever menstruasjonssyklusendringer og betydelige fysiologiske endringer som involverer ulike celler og vev. Disse endringene kan alvorlig påvirke kvinners livskvalitet og helse. Å utforske effekten av FSH kan forbedre kvinners livskvalitet og helse.
FSH skilles ut fra gonadotrope celler i fremre hypofyse og er avgjørende for å kontrollere gonadefunksjon og reproduksjon2. Funksjonen til FSH formidles gjennom FSH-reseptoren (FSHR), som tilhører G-proteinkoblet reseptor (GPCR)3. FSHR uttrykkes vanligvis i gonader, nemlig eggstokken og testisene. Det har blitt bevist at FSHR er universelt uttrykt i flere ekstragonadale celler og vev, inkludert lever4, hippocampus5, osteoklaster6, adipocytter7 og endotelceller8. Nye studier har avslørt ekstra gonadale virkninger av FSH og dens potensielle kliniske relevans i dyslipidemi4, Alzheimers sykdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kreft12. Derfor er det spesielt viktig å bygge en dyremodell som kan bidra til å studere de uavhengige effektene av FSH in vivo for å utforske virkningene av FSH alene.
I protokollen introduserte vi prosedyren for å etablere en musemodell med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-nivåer13. Musemodellen etterligner overgangsalderen ved ovariektomisert kirurgi og deretter supplert med østradiolvalerat og rekombinant FSH. Da de ovariektomiserte musene ble supplert med eksogent østrogen for å opprettholde lignende østrogennivåer med de skamopererte musene, var nivåene av endogen FSH stabile på grunn av østrogentilbakemelding i hypofysen. I denne tilstanden, kan det kontrollere FSH nivåer ved å administrere eksogene FSH uten å endre østrogennivå. Dermed kan OVF-musemodellen utelukke påvirkning av østrogen og observere de ekstragonadale fysiologiske og patologiske effektene av FSH. Vi tror den detaljerte og visualiserte prosedyren er nyttig for forskere å etablere OVF-musemodellen i laboratoriet og bruke den til å undersøke fysiologiske og patologiske endringer under overgangsalderen etter behov.
Protocol
Følgende protokoll var i samsvar med alle institusjonelle etiske retningslinjer for bruk av forsøksdyr og ble godkjent av dyreetikkomiteen ved Shandong Provincial Hospital, Kina. Alle kirurgiske manipulasjoner ble utført under dyp anestesi, og dyrene opplevde ikke smerte på noe stadium under prosedyren.
1. Forberedelse før operasjonen
- Instrument sterilisering
- Dampsteriliser kirurgiske instrumenter i en autoklav (121 °C i 15 minutter) før operasjonen. Forbered tilstrekkelige engangssuturer og nåler.
- Oppsett av operasjonsplattform
- Utfør operasjonen i et rom dedikert til kirurgiske prosedyrer. Tilordne et benkområde på minst 60 cm x 60 cm for operasjonen. Rengjør overflaten av området med 75% alkohol og dekk til med et medisinsk engangshåndkle, og desinfiser det deretter med ultrafiolett stråling 30 minutter på forhånd (figur 1A).
- Dyr forberedelse
- Oppbevar alle dyrene i et temperaturkontrollert rom (20-25 °C) med en mørk syklus på 12 timer og 12 timer. Akklimatisere 8 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus til boliganlegget i 1 uke før operasjonen.
- Vei mus før operasjonen. Administrer alle 9 uker gamle hunnmus med generell anestesi ved intraperitoneal injeksjon av tribromoetanol (280 mg / kg), for å oppnå smertefrihet på et hvilket som helst stadium under prosedyren. Injiser meloksikam (2 mg/kg) subkutant, ca. 1 time før en operasjon for å lindre smerte.
- Påfør øyesalve for å forhindre tørrhet i hornhinnen under operasjonen.
- Påfør hårfjerningslotion på ryggen ved hjelp av en ren bomullspinne. La lotionen sitte på en mus i 3-5 minutter, og fjern deretter håret ved hjelp av gasbind og bomullspinner. Gjenta dette trinnet til alt håret er fjernet fra baksiden av musen.
- Bruk gasbind og bomullspinne til å rengjøre huden med 75% alkohol. Fest musen på operasjonsplattformen opp igjen ved hjelp av en gummilist eller bomullstau (figur 1B) og bruk iodophor løsning for å rengjøre ryggen.
MERK: Bekreft dybden av anestesi via en tå-klemme før Ovariectomy.
2. Ovariektomi
MERK: Tribromoetanol kan opprettholdes i ca. 30 minutter, slik at operasjonen fullføres så mye som mulig.
- Lag et ~ 1,0 cm dorsalt snitt i lengderetningen fra lårbunnen og oppover ved hjelp av en engangsskalpell, slik at bare huden og subkutan fascia er snittet og unngå å kutte i bakre peritoneum på dette tidspunktet.
- Trekk snittet til venstre, og en hvit fettpute kan ses. Klipp ~ 0,5 cm langs den hvite fettputen for å eksponere det intraperitoneale hulrommet ved hjelp av mikrotang og saks.
- Etter å ha kuttet den bakre bukhinnen, fjern sakte og forsiktig den hvite fettputen fra det intraperitoneale hulrommet med mikrotang. Fukt umiddelbart det hvite fettvevet med 0,9% sterilt saltvann utenfor det gjennomvåt gasbindet. Hold eksponert vev alltid fuktet mens utenfor bukhulen.
- En rosa granulær substans, nemlig eggstokken, er festet til den nedre delen av den hvite fettputen (figur 2A). Eggstokkene er forbundet med en slank kanal, nemlig livmoren. Bruk 5-0 absorberbare suturer for å ligere eggstokkenden av livmoren og fjern venstre eggstokk (figur 2B).
- Når du fjerner en eggstokk, må du bevare det omkringliggende fettvevet så mye som mulig. Unngå direkte kontakt mellom kirurgiske instrumenter og eggstokkene og forhindre intraperitoneal implantasjon av eggstokkvev.
- Legg forsiktig den hvite fettputen tilbake i det intraperitoneale hulrommet. Utfør en enkel intermitterende sutur på bakre peritoneum med en 5-0 absorberbar sutur (figur 2C). Etter at suturen er fullført, rengjør eventuell blødning med 0,9% sterilt saltvannsfuktet gasbind.
- Trekk hudsnittet til høyre og fjern riktig eggstokk med samme metode.
- Utfør en intermitterende sutur med 4-0 ikke-absorberbare suturer og rengjør eventuell blødning med 0,9% sterilt saltvannsfuktet gasbind (figur 2D).
- Rengjør såret med en iodophor løsning etter å ha fullført begge suturene. Intraperitonealt injiserer bredspektret antibiotika.
3. Observasjon etter operasjonen
- Flytt musene til et teppe med konstant temperatur på 37 °C etter operasjonen. Inntil musene kan bevege seg fritt, hold dyrene i deres individuelle bur. Ikke forlat dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile.
- Injiser meloksikam (2 mg/kg) subkutant 24 timer etter operasjonen for å lindre smerte.
- Overvåk musene daglig for å sikre at operasjonssåret leges ordentlig uten tegn på komplikasjoner (dehiscens) tilstede.
4. Østradiol-tilskudd
- Forbered fôr supplert med østradiolvalerat. Bruk 2,6 mg beta-østradiol 17-valerat supplert per 1 kg mat.
- På 3 dager etter ferdigstillelse av operasjonen, mate musene med østradiolvalerat.
5. FSH injeksjon
- Klargjør rekombinant human FSH-oppløsning. Løs opp rekombinant humant FSH pulver til injeksjon med 0,9 % steril saltoppløsning til 100 IE/ml.
- Grupper mus i henhold til eksperimentelle planer og gi løsemiddel eller forskjellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injeksjon i 2 uker. I henhold til den biologiske aktiviteten til rekombinant FSH, bruk injeksjonsdosen av FSH hos mus tilsvarende serum-FSH-nivået hos kvinner i overgangsperioden i overgangsperioden.
MERK: Basert på forskjellige behandlinger ble ovariektomiserte østrogentilskudd mus tilfeldig delt inn i tre grupper, løsningsmiddel (N.S.) gruppe som fikk 100 μL / dag løsningsmiddel, lavdose FSH (L-FSH) gruppe som fikk 15 IE / kg kroppsvekt per dag og høydose FSH (H-FSH) gruppe som fikk 30 IE / kg kroppsvekt per dag.
Representative Results
OVF-musemodellen etterligner det tidlige stadiet av overgangsalderen med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-nivåer13. For det første, for eggstokkfjerningskirurgi, ble 9 uker gamle kvinnelige C57BL / 6-mus administrert generell anestesi og utsatt for enten en sham-operasjon (Sham) eller bilateral ovariektomi (OVX). Da smørebilder av Papanicolaou-fargede celler tydelig identifiserte proestrus-, østrus-, metestrus- og diestrusstadiene i brunstsyklusen, mistet OVX-musene brunstsyklusen (figur 3A), og ELISA-metoden viste en signifikant reduksjon i serumøstradiol (E2) nivåer (figur 3B). For det andre ble OVX-musene supplert med beta-østradiol 17-valerat (OVX + E2) for å opprettholde serum østrogen på samme nivå som Sham-gruppen. For det tredje fikk OVX + E2-musene løsningsmiddel (N.S.) eller forskjellige doser rekombinant FSH via intraperitoneal injeksjon for å lage en musemodell (OVF) karakterisert ved relativt stabilt østrogen og stigende FSH-nivåer (figur 4).
Figur 1. Kirurgisk miljø og musestilling. (A) Et benkområde på minst 60 cm x 60 cm for operasjonen. Rengjør overflaten av området med 75% alkohol og dekk det med et engangs medisinsk håndkle, og desinfiser deretter med ultrafiolett stråling 30 minutter på forhånd. (B) Fest musen på operasjonsplattformen opp igjen ved hjelp av en gummistrimmel eller bomullstau. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Viktige trinn i kirurgisk operasjon. (A) Ovariestilling, (B) ovariektomi, (C) suturperitoneum og (D) suturhudsnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Vaginal cytologi. Vaginal cytologi representerer stadier av brunstsyklusen og endogent østrogen i de ovariektomiserte musene (OVX) og de humbugopererte (Sham; n = 12 for Sham-gruppen; n = 10 per OVX-grupper). (A) Vaginal cytologi representerer stadier av brunstsyklusen i henhold til den relative tilstedeværelsen av leukocytter, cornified epitelceller og nukleerte epitelceller. Stadier av østrus inkluderer proestrus, overvekt av kjernefysiske epitelceller; østrus, overvekt av enucleated cornified celler; metestrus, tilstedeværelsen av leukocytter og cornified og nukleerte epitelceller; Diestrus, overvekt av leukocytter. Skala bar = 100 μm. (B) Endogent østrogen i ovariektomiserte mus (OVX) og humbug-opererte (Sham). Data vises som gjennomsnitt ± SEM. Student t-test brukes til statistisk analyse. s< 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. OVF-modell og serumhormonnivåer. (A) Flytskjema OVF-modell. (B) ELISA-analyse av serumøstrogen (E2) og FSH-konsentrasjoner. Data er representert som gjennomsnittet ± SEM. Enveis ANOVA ble brukt til statistisk analyse. * s< 0,05 og ** p< 0,01. Dette tallet er endret fra4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Under overgangen fra en reproduktiv til en ikke-reproduktiv fase (overgangsalder) opplever mange kvinner betydelige fysiologiske og patologiske forandringer. Nivåer av FSH stige under overgangsalderenovergangen 1. Nye studier har vist at FSH i ulike ekstragonadale vev og organer er kritisk i patogenesen av flere sykdommer, inkludert dyslipidemi4, Alzheimers sykdom5, osteoporose 9,10, aterosklerose11, fedme9 og kreft12. Derfor er det spesielt viktig å bygge en dyremodell som kan bidra til å studere de uavhengige effektene av FSH in vivo. OVF-musemodellen etterligner det tidlige stadiet av overgangsalderen med relativt stabilt østrogen og stigende FSH-nivåer og er spesielt egnet for studier for å utforske de ekstragonadale virkningene av FSH.
Ved denne metoden ble det gjort ovariektomi med et enkelt ryggsnitt, ca. 1 cm fra lårbasen og oppover (figur 1B). Huden ble skåret nesten sammen med ryggmuskulaturen ved hjelp av skarp dissekerende saks, og man fikk dermed tilgang til bukhulen. Etter operasjonen krevde muskelsnittet ingen suturering, og hudsåret ble lukket bilateralt med én kattarmsutur (figur 2). Operasjonen er teknisk enklere, mindre tidkrevende og mindre skadelig for hunnmus sammenlignet med andre metoder som brukes.
Noen detaljer som bør ivaretas under operasjonsprosedyren. Først bør alle kirurgiske prosedyrer holdes rene og så sterile som mulig for å redusere risikoen for postoperativ infeksjon. For det andre, fordi eggstokkvevet er svært skjøre, kan kirurgiske instrumenter ikke kontakte eggstokkene direkte under ovariektomi, for å unngå intraperitoneal implantasjon. For det tredje, etter operasjonen, ble musene flyttet til et 37 ° C konstant temperaturteppe under utvinning for å forhindre postoperativ hypotermi som førte til døden.
En tidligere studie har vist at endogent østrogen syntetiseres i ovarie theca celler av premenopausale kvinner eller adipose stromale celler i brystet av postmenopausale kvinner og i mindre mengder i perifert vev14. Serumøstrogen falt kraftig for ovariektomerte mus, men kan ikke elimineres (figur 3B). Imidlertid påvirker endogent østrogen syntetisert i ekstragonadalt vev ikke stabiliteten av østrogennivået i OVF-modellen (figur 4B).
Det er noen begrensninger i OVF-modellen. Når den kirurgiske operasjonen ikke er forsiktig og fører til ovarial intraperitoneal implantasjon, kan det føre til modellsvikt. I dette tilfellet faller serumøstrogenet ikke kraftig og svinger i forskjellige stadier av brunstsyklusen. Etter eksogen administrering av østrogen og FSH tar det ca. 1 uke for kroppen å nå likevekt. Dermed kan patologiske endringer i OVF-modellen som oppstår innen 1 uke ikke indikere effekten av FSH.
Avslutningsvis har OVF-modellen fordelene ved å være stabil, billig og enkel å betjene. De systemiske effektene av høyt nivå FSH kan observeres etter intraperitoneal injeksjon av FSH; det vil si at OVF-modellen er egnet for studier som undersøker de ekstragonadale virkningene av FSH. Imidlertid er kravene til modellkirurgi og intraperitoneale injeksjonsprosedyrer ganske høye. Hvis finansieringen er tilstrekkelig, er spesifikke knockout-modeller det beste valget.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke dyrelaboratoriet ved Shandong Provincial Hospital for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC 82101645), Natural Science Foundation of Shandong Province, Kina (ZR2020QH088), og Science and Technology Support Plan for Youth Innovation of Colleges i Shandong-provinsen (2021KJ051).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
