Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Summary

Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l’organizzazione locale all’interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull’organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Abstract

Rispetto alla sua controparte a un fotone, l’eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l’introduzione dell’analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell’organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell’ordinamento molecolare all’interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l’Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L’esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell’ordinamento locale delle fibrille all’interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l’organizzazione tridimensionale delle fibrille all’interno della sferulite.

Introduction

Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati¹, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all’interno del campione ^2,3. La^microscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l’eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell’ordinamento locale all’interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferuliti potrebbe essere risolta utilizzando metodi sensibili alla polarizzazione³. Tuttavia, le tecniche di fluorescenza standard con penetrazione superficiale nei tessuti sono limitate poiché l’utilizzo di lunghezze d’onda UV-VIS per eccitare i fluorofori in vivo porta a un’elevata diffusione della luce tissutale⁵. Inoltre, tale imaging richiede spesso la progettazione e il legame di sonde fluorescenti specifiche a una biomolecola mirata, aumentando così il costo e la quantità di lavoro necessario per eseguire l’imaging.

Recentemente, per affrontare questi problemi, il nostro team ha adattato la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) per l’imaging label-free di strutture biologiche ^6,7. Ps-2PFM consente di misurare la dipendenza dell’intensità della fluorescenza a due fotoni dalla direzione della polarizzazione lineare del fascio di eccitazione e di analizzare la polarizzazione della fluorescenza emessa⁸. L’implementazione di questa tecnica richiede l’integrazione del percorso di eccitazione standard del microscopio multi-fotone (Figura 1) con una piastra a semionda per controllare il piano di polarizzazione della luce. Quindi, i grafici polari, che descrivono la dipendenza dell’intensità della fluorescenza eccitata a due fotoni dalla polarizzazione del raggio laser di eccitazione, vengono creati dai segnali raccolti da due fotodiodi a valanga, raccogliendo così le due componenti reciprocamente perpendicolari della polarizzazione della fluorescenza.

L’ultimo passaggio è il processo di analisi dei dati, tenendo conto dell’impatto degli elementi ottici, come gli specchi dicroici o un obiettivo ad alta apertura numerica, sulla polarizzazione. A causa della natura del processo a due fotoni, questo metodo fornisce sia una ridotta fotoselezione angolare che una migliore risoluzione assiale, poiché l’eccitazione a due fotoni dei fluorofori al di fuori del piano focale è probabilisticamente limitata. È stato inoltre dimostrato che metodi simili potrebbero essere implementati con successo per l’imaging in vivo di sonde nel vicino infrarosso (NIR) per l’imaging dei tessuti profondi⁹. Ps-2PFM è stato precedentemente applicato a fluorofori di immagine nelle membrane cellulari¹⁰ e DNA^11,12, nonché a marcatori fluorescenti non standard di sistemi biologici, come le nanoparticelle d’oro¹³. Tuttavia, in tutti questi esempi, le informazioni sull’organizzazione delle biomolecole sono state ottenute indirettamente e hanno richiesto un orientamento reciproco predefinito tra un fluoroforo e una biomolecola.

In uno dei nostri recenti articoli, abbiamo dimostrato che la ps-2PFM potrebbe essere applicata con successo per determinare la polarizzazione locale dell’autofluorescenza delle sovrastrutture amiloidi e la fluorescenza dalla tioflavina T, un colorante specifico per l’amiloide, legato alle fibrille amiloidi nelle sferuliti⁶. Inoltre, in un altro, abbiamo dimostrato che ps-2PFM potrebbe essere utilizzato per rilevare l’orientamento delle fibrille amiloidi all’interno delle sferuliti amiloidi in un regime di dimensioni inferiori al micron, che è stato confermato correlandolo con l’imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)⁷. Il raggiungimento di questo risultato è stato possibile grazie a i) autofluorescenza intrinseca di sferuliti-amiloidi, quando eccitate con uno o due fotoni, mostrano un’autofluorescenza intrinseca con massimi di emissione situati in un intervallo compreso tra 450 e 500 nm e sezioni d’urto di assorbimento a due fotoni paragonabili ai coloranti fluorescenti standard¹⁴, ii) modelli matematici introdotti in precedenza per descrivere come ps-2PEF di coloranti che marcano membrane biologiche e strutture del DNA potrebbero essere applicati a fluorescenza esibita da sferuliti e coloranti ad essi legati ^8,11,15. Pertanto, prima di procedere con l’analisi, consigliamo vivamente di esaminare la teoria richiesta descritta sia nel testo principale che nelle informazioni di supporto del nostro primo articolo riguardante questo argomento⁶. Qui, presentiamo il protocollo su come applicare la tecnica ps-2PFM per una caratterizzazione strutturale amiloide label-free di sferuliti di insulina bovina.

Protocol

1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell’acqua. Incubare le sferuliti amiloidi in base al protocollo descritto da Krebs et al1…

Representative Results

Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differ…

Discussion

La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l’ordinamento locale delle fibrille all’interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una mino…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5