Et automatiseret dyrkningssystem til vedligeholdelse og differentiering af menneskeskabte pluripotente stamceller
Summary
Her præsenterer vi en protokol til et automatiseret cellekultursystem. Dette automatiserede dyrkningssystem reducerer arbejdskraft og gavner brugerne, herunder forskere, der ikke er bekendt med håndtering af inducerede pluripotente stamceller (iPS), fra vedligeholdelse af iPS-celler til differentiering i forskellige typer celler.
Abstract
Humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) med uendelig selvprolifererende evne forventes at have anvendelser på mange områder, herunder belysning af sjældne sygdomspatologier, udvikling af nye lægemidler og regenerativ medicin, der sigter mod at genoprette beskadigede organer. På trods af dette er den sociale implementering af hiPSC’er stadig begrænset. Dette skyldes til dels, at det er vanskeligt at reproducere differentiering i kultur, selv med avanceret viden og sofistikerede tekniske færdigheder, på grund af iPSC’ernes store følsomhed over for små miljøændringer. Anvendelsen af et automatiseret kultursystem kan løse dette problem. Eksperimenter med høj reproducerbarhed uafhængig af en forskers færdigheder kan forventes i henhold til en fælles procedure på tværs af forskellige institutter. Selvom der tidligere er udviklet flere automatiserede kultursystemer, der kan opretholde iPSC-kulturer og fremkalde differentiering, er disse systemer tunge, store og dyre, fordi de gør brug af humaniserede, multiartikulerede robotarme. For at forbedre ovenstående problemer udviklede vi et nyt system ved hjælp af et simpelt x-y-z-akseglideskinnesystem, så det kunne være mere kompakt, lettere og billigere. Desuden kan brugeren nemt ændre parametre i det nye system for at udvikle nye håndteringsopgaver. Når en opgave er etableret, skal brugeren blot forberede iPSC, på forhånd levere de reagenser og forbrugsstoffer, der er nødvendige for den ønskede opgave, vælge opgavenummeret og angive tidspunktet. Vi bekræftede, at systemet kunne opretholde iPSC’er i en udifferentieret tilstand gennem flere passager uden fødeceller og differentiere sig til forskellige celletyper, herunder kardiomyocytter, hepatocytter, neurale forfædre og keratinocytter. Systemet vil muliggøre meget reproducerbare eksperimenter på tværs af institutioner uden behov for kvalificerede forskere og vil lette den sociale implementering af hiPSC’er på en bredere vifte af forskningsområder ved at mindske hindringerne for nye indgange.
Introduction
Denne artikel har til formål at give faktiske og detaljerede håndteringsprocedurer for et automatiseret dyrkningssystem for humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC), som vi producerede i samarbejde med et firma, og at vise repræsentative resultater.
Siden offentliggørelsen af artiklen i 2007 har iPSC tiltrukket sig opmærksomhed over hele verden1. På grund af dets største træk ved at kunne differentiere sig til enhver form for somatisk celle forventes det at blive anvendt på forskellige områder såsom regenerativ medicin, belysning af årsagerne til uhåndterlige sygdomme og udvikling af nye terapeutiske lægemidler 2,3. Desuden kan anvendelse af humane somatiske celler afledt af iPSC reducere dyreforsøg, som er underlagt betydelige etiske restriktioner. Selvom mange homogene iPSC’er konstant kræves for at undersøge nye metoder med iPSC’er, er det for besværligt at administrere dem. Desuden er håndtering af iPSC vanskelig på grund af dens høje følsomhed, selv over for subtile kulturelle og miljømæssige ændringer.
For at løse dette problem forventes automatiserede kultursystemer at udføre opgaver i stedet for mennesker. Nogle grupper har udviklet nogle få automatiserede humane pluripotente stamcellekultursystemer til cellevedligeholdelse og differentiering og offentliggjort deres resultater 4,5,6. Disse systemer udstyrer multiartikulerede robotarme. Robotarme har ikke kun fortjeneste, fordi de i høj grad efterligner menneskelige armbevægelser, men også ulemper, idet de kræver højere omkostninger til armen (e), større og tungere systememballage og tidskrævende uddannelsesindsats fra ingeniørerne for at opnå de målrettede bevægelser 7,8. For at gøre det lettere at introducere apparatet til flere forskningsfaciliteter på steder med økonomisk, rum- og menneskeressourceforbrug har vi udviklet et nyt automatiseret kultursystem til vedligeholdelse og differentiering af iPSC i forskellige celletyper9.
Vores begrundelse for det nye system var at vedtage et X-Y-Z-akseskinnesystem i stedet for multiartikulerede robotarme9. For at erstatte robotarmenes komplekse håndlignende funktioner anvendte vi en ny idé på dette system, som automatisk kan ændre tre typer specifikke funktionelle armspidser. Her angiver vi også, hvordan brugere nemt kan lave opgaveplaner med enkle ordrer på software på grund af manglende krav til ingeniørers bidrag gennem hele processen.
Et af robotkultursystemerne har demonstreret fremstillingen af embryoide kroppe ved hjælp af 96-brøndplader som 3D-celleaggregater til differentiering4. Det her rapporterede system kan ikke håndtere plader med 96 brønde. Man opnåede den nuværende gode fremstillingspraksis (cGMP) kvalitet ved hjælp af en cellelinje, selv om det ikke var en human pluripotent stamcelle5. Det automatiserede dyrkningssystem, der er beskrevet her, er nu udviklet med det specifikke formål at hjælpe laboratorieforsøg (figur 1). Det har dog nok systemer til at holde rene niveauer svarende til et niveau IV sikkerhedsskab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk trin i protokollen er, at hvis en bruger finder fejl, skal du klikke på knappen Annuller, Stop eller Nulstil når som helst og starte forfra fra det første trin. Softwaren kan undgå menneskelige fejl, herunder dobbeltbooking, åbning af døre, mens systemopgaverne er aktive og manglende genopfyldning. Et andet kritisk punkt for vellykket og effektiv differentiering til den ønskede somatiske celle er den korrekte udvælgelse af pluripotente stamcellelinjer, fordi hver pluripotent stamcelle har en ukontrolla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
