인도시아닌 녹색 혈관 조영술에 의한 신생혈관 연령 관련 황반변성의 혈관 형태 특성 분석
Summary
현재 형광 혈관 조영술(FA)은 맥락막 신생혈관 형성(CNV)의 동물 모델에서 누출 패턴을 식별하는 데 선호되는 방법입니다. 그러나 FA는 혈관 형태에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델에서 레이저 유도 CNV의 다양한 병변 유형을 특성화하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.
Abstract
연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인 실명의 주요 원인이며 인구 고령화로 인해 유병률이 빠르게 증가하고 있습니다. 맥락막 신생혈관 형성(CNV) 또는 습성 AMD는 모든 AMD 사례의 10%-20%를 차지하며, AMD 관련 실명의 80%-90%를 차지합니다. 현재의 항-VEGF 치료법은 환자의 약 50%에서 차선의 반응을 보인다. CNV 환자에서 항-VEGF 치료에 대한 내성은 종종 동맥 CNV와 관련이 있는 반면, 반응자는 모세혈관 CNV를 갖는 경향이 있다. 플루오레세인 혈관 조영술(FA)은 습성 AMD 환자 및 동물 모델의 누출 패턴을 평가하는 데 일반적으로 사용되지만, CNV 혈관 형태(세동맥 CNV 대 모세혈관 CNV)에 대한 정보는 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 레이저 유도 CNV 마우스 모델의 병변 유형을 특성화하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 방법을 소개합니다. 이 방법은 습성 AMD에서 항-VEGF 내성에 대한 메커니즘과 치료 전략을 조사하는 데 중요합니다. 기계론 및 치료 연구에서 CNV의 누출 및 혈관 특징에 대한 포괄적인 평가를 위해 FA와 함께 ICGA를 통합하는 것이 좋습니다.
Introduction
연령 관련 황반 변성(AMD)은 노인에게 심각한 시력 상실을 초래하는 흔한 질환입니다1. 미국에서만 AMD 환자 수가 현재 1,100만 명에서 2050년까지 거의 2,200만 명에 달할 것으로 예상됩니다. 전 세계적으로 AMD 확진자 수는 2040년까지 무려 2억 8,800만 명에 이를 것으로 예상됩니다2.
“습성” 또는 신생혈관성 AMD라고도 알려진 맥락막 신생혈관형성(CNV)은 중앙 망막 아래에 비정상적인 혈관이 형성되어 시력에 치명적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 출혈, 망막 삼출 및 심각한 시력 상실이 발생합니다. 세포외 VEGF를 표적으로 하는 항혈관내피성장인자(VEGF) 치료제의 도입은 CNV 치료에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 최대 50%의 환자가 이러한 치료법에 대해 차선의 반응을 보이며, 체액 축적 및 해결되지 않은 출혈 또는 새로운 출혈과 같은 지속적인 질병 활동을 보인다 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
임상 연구에 따르면 CNV 환자에서 항-VEGF 내성은 종종 대구경 분지 세동맥, 혈관 루프 및 문합 연결을 특징으로 하는 세동맥 CNV의 존재와 일치한다9. 반복적인 항-VEGF 치료는 혈관 이상화, 동맥 CNV의 발달, 그리고 궁극적으로 항-VEGF 요법에 대한 내성에 기여할 수 있다14,15. 동맥 CNV의 경우, 동정맥 문합 루프에서 부적절하게 형성된 단단한 접합부, 특히 혈류량이 높은 조건에서 삼출액이 증가하여 지속적인 체액 누출이 발생할 수 있다9. 반대로, 항-VEGF 치료에 잘 반응하는 개인은 모세혈관 CNV를 나타내는 경향이 있습니다.
동물 모델을 이용한 우리의 연구에서, 우리는 나이 든 쥐에서 레이저 유도 CNV가 동맥 CNV를 개발하고 anti-VEGF 치료에 대한 내성을 나타낸다는 것을 입증했다16,17. 반대로, 젊은 마우스에서 레이저 유도 CNV는 모세관 CNV의 발달과 항-VEGF 치료에 대한 높은 반응성으로 이어집니다. 따라서 기계론적 및 치료적 연구를 위해 CNV 혈관 유형을 구별하는 것이 중요합니다.
임상 환경에서 CNV는 일반적으로 플루오레세인 염료를 사용하여 삼출물을 추적하고 병리학적 누출 영역을 식별하는 형광 혈관 조영술(FA) 누출 패턴(예: 유형 1, 유형 2)을 기반으로 분류됩니다. AMD 연구에서 CNV는 주로 동물 모델에서 FA를 사용하여 연구됩니다. 그러나 FA는 CNV의 혈관 형태를 밝히지 못했습니다. 또한 FA는 가시광선 스펙트럼의 이미지만 캡처하고 망막 색소 상피(RPE) 아래의 맥락막 혈관을 시각화할 수 없습니다. 대조적으로, 혈장 단백질에 대한 강한 친화력을 나타내는 인도시아닌 그린(ICG)은 우세한 혈관 내 유지를 촉진하고 혈관 구조와 혈류의 시각화를 가능하게 한다9. ICG의 근적외선 형광 특성을 활용하여 ICG 혈관 조영술(ICGA)을 사용하여 망막 및 맥락막 색소를 이미지화할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 FA와 ICGA를 결합하여 모세혈관 및 세동맥 CNV가 관찰되는 젊은 마우스와 늙은 마우스에서 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV)의 누출 및 혈관 형태를 조사하는 프로토콜이 제시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 레이저 유도 CNV가 있는 마우스 모델에서 세동맥 및 모세관 맥락막 신생혈관화(CNV)의 혈관 형태를 식별하기 위해 인도시아닌 녹색 혈관 조영술(ICGA)을 사용하는 것을 보여주었습니다. 인도시아닌 그린(ICG) 염료의 헤모글로빈 결합 및 적외선 특성은 현재 연구 커뮤니티에서 사용하는 방법인 형광 혈관 조영술(FA)을 사용하여 달성하기 어려운 CNV 형태를 검출할 수 있게 했습니다.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 BrightFocus Foundation, Retina Research Foundation, Mullen Foundation, Sarah Campbell Blaffer Endowment in Ophthalmology의 YF 보조금, Baylor College of Medicine의 NIH 핵심 보조금 2P30EY002520, Baylor College of Medicine의 안과학과에 대한 Research to Prevent Blindness의 무제한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
