Experimentos de Optogenética de Alto Rendimento em Leveduras Usando a Plataforma Automatizada Lustro
Summary
Este protocolo descreve as etapas para a utilização da plataforma automatizada Lustro para realizar a caracterização de alto rendimento de sistemas optogenéticos em leveduras.
Abstract
A optogenética oferece controle preciso sobre o comportamento celular utilizando proteínas sensíveis à luz codificadas geneticamente. No entanto, a otimização desses sistemas para alcançar a funcionalidade desejada geralmente requer vários ciclos de projeto-construção-teste, que podem ser demorados e trabalhosos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos o Lustro, uma plataforma que combina estimulação luminosa com automação laboratorial, permitindo triagem e caracterização eficientes de sistemas optogenéticos de alto rendimento.
A Lustro utiliza uma estação de trabalho de automação equipada com um dispositivo de iluminação, um dispositivo de agitação e um leitor de placas. Ao empregar um braço robótico, o Lustro automatiza o movimento de uma placa de micropoço entre esses dispositivos, permitindo a estimulação de cepas optogenéticas e a medição de sua resposta. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre o uso de Lustro para caracterizar sistemas optogenéticos para controle da expressão gênica em levedura brotante Saccharomyces cerevisiae. O protocolo abrange a configuração dos componentes do Lustro, incluindo a integração do dispositivo de iluminação com a estação de trabalho de automação. Ele também fornece instruções detalhadas para a programação do dispositivo de iluminação, leitor de placas e robô, garantindo uma operação suave e aquisição de dados durante todo o processo experimental.
Introduction
A optogenética é uma técnica poderosa que utiliza proteínas sensíveis à luz para controlar o comportamento das células com alta precisão 1,2,3. No entanto, a prototipagem de construtos optogenéticos e a identificação de condições ótimas de iluminação podem ser demoradas, dificultando a otimização de sistemas optogenéticos 4,5. Métodos de alto rendimento para selecionar e caracterizar rapidamente a atividade de sistemas optogenéticos podem acelerar o ciclo de projeto-construção-teste para prototipar construções e explorar sua função.
A plataforma Lustro foi desenvolvida como uma técnica de automação laboratorial projetada para triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento. Ele integra um leitor de microplacas, dispositivo de iluminação e dispositivo de agitação com uma estação de trabalho de automação6. O Lustro combina cultura automatizada e estimulação luminosa de células em placas de micropoços (Figura 1 e Figura Suplementar 1), possibilitando a rápida triagem e comparação de diferentes sistemas optogenéticos. A plataforma Lustro é altamente adaptável e pode ser generalizada para trabalhar com outros robôs de automação laboratorial, dispositivos de iluminação, leitores de placas, tipos de células e sistemas optogenéticos, incluindo aqueles responsivos a diferentes comprimentos de onda de luz.
Este protocolo demonstra a configuração e o uso do Lustro para a caracterização de um sistema optogenético. O controle optogenético de fatores de transcrição divididos em leveduras é usado como um sistema de exemplo para ilustrar a função e utilidade da plataforma, investigando a relação entre entradas de luz e a expressão de um gene repórter fluorescente, mScarlet-I7. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem agilizar a otimização de sistemas optogenéticos e acelerar a descoberta de novas estratégias para o controle dinâmico de sistemas biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo Lustro aqui apresentado automatiza os processos de cultivo, iluminação e medição, permitindo a triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento6. Isso é conseguido integrando um dispositivo de iluminação, leitor de microplacas e dispositivo de agitação em uma estação de trabalho de automação. Este protocolo demonstra especificamente a utilidade de Lustro para a triagem de diferentes construtos optogenéticos integrados à levedura S. cerevisiae<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R35GM128873 e pelo National Science Foundation grant 2045493 (concedido ao M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. tem um Prêmio de Carreira na Interface Científica do Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NHGRI para o Programa de Treinamento em Ciências Genômicas 5T32HG002760. Reconhecemos discussões frutíferas com os membros do laboratório McClean e, em particular, somos gratos a Kieran Sweeney por fornecer comentários sobre o manuscrito.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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