Denne metode giver en tilgængelig og fleksibel protokol til fremstilling af elektronmikroskopi (EM) gitter til in situ cellulær kryotomografi og korrelativt lys og elektronmikroskopi (CLEM).
In situ cellulær kryotomografi er en kraftfuld teknik til at studere komplekse objekter i deres oprindelige frosne hydrerede cellulære kontekst, hvilket gør det yderst relevant for cellulær biologi og virologi. Potentialet ved at kombinere kryotomografi med andre mikroskopimetoder gør det til en perfekt teknik til integrativ og korrelativ billeddannelse. Imidlertid er prøveforberedelse til in situ cellulær tomografi ikke ligetil, da celler ikke let fastgør og strækker sig over elektronmikroskopigitteret. Derudover er selve gitterene skrøbelige og kan gå i stykker, hvis de håndteres for kraftigt, hvilket resulterer i tab af billedområder. Geometrien af vævskulturskåle kan også udgøre en udfordring, når man manipulerer gitterene med pincet. Her beskriver vi tips og tricks til at overvinde disse (og andre) udfordringer og forberede prøver af god kvalitet til in situ cellulær kryotomografi og korreleret billeddannelse af klæbende pattedyrceller. Med fortsatte fremskridt inden for kryomikroskopiteknologi rummer denne teknik et enormt løfte om at fremme vores forståelse af komplekse biologiske systemer.
In situ cellulær kryotomografi er en kraftfuld teknik, der giver mulighed for undersøgelse af biologisk relevante strukturer i celler uden kemisk fiksering. Ved at binde celler til EM-gitre og dykfryse gitterene i et kryogen, fastfryses objekter af interesse i deres naturlige cellulære sammenhænge uden dannelse af krystallinsk is fra intracellulært vand 1,2. Både kemisk fiksering og krystallinsk isdannelse kan forstyrre strukturerne af relevante molekyler, såsom proteiner og lipider, hvilket reducerer den biologiske nøjagtighed af billeder opnået ved hjælp af disse teknikker 3,4. I tomografi afbildes gitre i inkrementelle vinkler ved hjælp af elektronmikroskopi, og disse billeder bruges derefter til at konstruere tredimensionelle repræsentationer af målområdet afbildet5. In situ kryotomografi kan anvendes sammen med andre mikroskopiteknikker til integrativ og korrelativ billeddannelse, såsom kryofluorescensbilleddannelse, blød røntgentomografi og kryoFIB/SEM (kryogen fokuseret ionstråle/scanningelektronmikroskopi)6,7,8,9,10,11 . Integration af flere teknikker gør det muligt at opnå mere information om en struktur eller proces, end nogen enkelt mikroskopiteknik kunne opnå.
På trods af alle fordelene ved in situ cellulær kryotomografi kan prøveforberedelse vise sig at være udfordrende af forskellige årsager. På grund af deres skrøbelighed kan kraftig manipulation af elektronmikroskopigitter føre til skade, hvor især det tynde kulstoflag er delikat og tilbøjeligt til at rive, hvilket reducerer gitterets billedområde. Elektronmikroskopigitter er også vanskelige at manipulere på grund af deres lille størrelse og er tilbøjelige til at løsne sig fra overfladen af brøndene eller mikrodias, der bruges til at dyrke celler. Manipulation af gitterene i brøndene eller mikrodiasene kan vise sig vanskelig på grund af geometrien af disse. Forkert forberedelse af gitterene (f.eks. At lade dem flyde) kan føre til lav celletæthed og reducere antallet af potentielle billeddannelsesområder, især når celler ikke er tilbøjelige til at binde sig til selve gitterene. For direkte cellulær kryotomografi skal celler spredes meget tyndt, hvilket kan forstyrres af mange grunde, herunder forkerte temperaturer eller grov håndtering af gitterene.
Gennem en række optimeringer er teknikkerne præsenteret i denne artikel beregnet til at håndtere disse mest almindelige faldgruber, der opstår under forberedelsen af elektronmikroskopigitter til kryotomografi. Brugen af 5/15 vinklede pincetter muliggør manipulation af gitter inden for brøndplader eller mikrodias. En fibronectinopløsning, der påføres begge sider af gitterene inden plettering, gør flydende gitter mindre sandsynlige, hvilket er gavnligt for at sikre, at gitter har tilstrækkelig celletæthed, og at gitterene er mindre tilbøjelige til at blive beskadiget på grund af manipulation. Ved at holde gitterene udruget ved 37 °C indtil lige før frysepunktet, sikrer vi også, at cellerne holdes i et behageligt miljø for at forhindre cellerne i at trække deres tynde kanter tilbage. Blotting af gitterene fra bagsiden forhindrer også beskadigelse af cellerne fra mekanisk kraft. Samlet set øger disse foranstaltninger succesraten for prøveforberedelse til in situ-cellulære kryotomografiundersøgelser, hvilket øger tilgængeligheden af denne billeddannelsesmetode.
Her har vi leveret en tilgængelig, fleksibel og reproducerbar protokol til frøceller på elektronmikroskopigitter til in situ kryoelektronotomografiapplikationer. Denne metode kan let tilpasses, så den passer til behovene i downstream-applikationer og/eller eksperimentelle krav. Ud over stor fleksibilitet har vi beskrevet en arbejdsgang, der optimerer og reducerer almindelige faldgruber i grid-såning, især omfattende skader på kulstoflaget, lav celletæthed og dårlig strukturel integritet af tyndcelleprojektioner.
Selvom protokollen beskrevet her giver flere alternativer, er der nogle kritiske trin, der skal følges for at optimere generelle resultater. Et af de største problemer med gittercellesåning er frigørelse og flydende gitter fra brønden eller mikrodiaset. Derfor er det vigtigt at vådte gitteret fuldt ud med en klæbende opløsning på begge sider og forhindre, at den tørrer i inkubationsperioden. Hvis du bruger 3D-printede netholdere, skal du være opmærksom på, at flere medieændringer til disse holdere har potentialet til at producere flydende gitre, da luften, der er fanget under gitteret, kan tvinge den ud af holderen.
Vores valg af pincet forbedrer også gitterkvaliteten i form af en geometrisk gunstig måde at manipulere gitterene på uden omfattende gitterbøjning, der ville skade kulstoflaget. At holde cellerne ved 37 °C så længe som muligt, før de kastes, reducerer cellelidelsen og forbedrer antallet af tynde billedceller på gitteret. Endelig vil blotting fra guldsiden beskytte cellerne mod hårde mekaniske kræfter, der kan føre til skade på skrøbelige cellulære strukturer.
Selvom det ikke er inkluderet i denne protokol, har gitterfotomikromønster vist sig at øge antallet af billedceller ved at optimere deres vedhæftning til midten af gitterkvadrater14. Endelig er 3D-printede netholdere for nylig blevet brugt til at reducere netskader ved at begrænse direkte netmanipulation12.
Det kan være vigtigt at bemærke, at denne protokol er optimeret til billeddannelse af tynde kanter og fremspring fra celler til anvendelse af kryotomografi. Vi foreslår fejlfinding af en række betingelser fra vores anbefalinger i protokollen for at finde det bedste resultat for de valgte downstream-applikationer. Samlet set giver denne protokol en pålidelig, men alsidig metode til såning af celler på gitter, der kan finjusteres til specifikke behov.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Mansky-laboratoriet for adgang til dykfrysningsudstyr. Dele af dette arbejde blev udført i karakteriseringsfaciliteten ved University of Minnesota, som modtager delvis støtte fra National Science Foundation (NSF) gennem Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Prisnummer DMR-2011401) og National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Prisnummer ECCS-2025124) programmer. Vi vil gerne takke finansiering fra Behavior of HIV in Viral Environments Center (B-HIVE; 1U54AI170855-01) og Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) centrum.
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |