이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신장 오가노이드는 다양한 접근법을 통해 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 이러한 오가노이드는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 잠재적인 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 글에서는 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 단계별 절차를 제시하며, 이는 PS(Posterior Primitive Streak)에서 시작하여 중간 중배엽(IM)까지 이어집니다. 이 접근법은 동물성 성분이 없는 정의된 배지인 APEL 2 배지에 의존합니다. 4일 동안 고농도의 WNT 작용제(CHIR99021)를 보충한 후 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9)/헤파린과 저농도 CHIR99021를 추가로 3일 동안 보충합니다. 이 과정에서는 성공적인 신장 오가노이드 생성에 매우 중요하기 때문에 iPSC를 시작할 때 최적의 세포 밀도와 CHIR99021 농도를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 낮은 점착 플레이트의 현탁 배양으로, IM이 사구체, 근위 관형 및 원위 관형 구조를 포함하는 네프론 구조로 점진적으로 발전할 수 있도록 하며, 모두 시각적으로 이해할 수 있는 형식으로 제공됩니다. 전반적으로, 이 상세한 프로토콜은 다양한 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 효율적이고 구체적인 기술을 제공하여 성공적이고 일관된 결과를 보장합니다.
서론
신장은 기능 단위에 따라 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 노폐물을 배출하는 네프론은 체액의 구성을 조절할 수 있습니다. 유전적 돌연변이 또는 기타 고위험 요인에 의해 발생하는 만성 신장 질환(CKD)은 결국 말기 신장 질환(ESKD)으로 진행됩니다1,2. ESKD는 네프론의 재생 능력이 제한되어 있기 때문인 것으로 보인다. 따라서 신대체 요법이 필요합니다. 인간 iPSC의 유도 분화는 신장 발달을 연구하고, 환자별 질병을 모델링하고, 신독성 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있는 환자별 3D 신장 오가노이드의 체외 생성을 가능하게 합니다 3,4.
배아 발달 과정에서 신장은 원시 줄무늬(PS)와 구별되는 중간 중배엽(IM)에서 유래합니다. 고전적인 WNT 신호전달 경로는 FGF(FGF9, FGF20) 및 BMP(JNK를 통한 Bmp7 신호전달)5,6,7의 조정된 참여로 IM의 추가적인 분화를 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
본 연구에 사용된 iPSC는 상업적 출처에서 얻은 것입니다. 세포는 시판되는 기저막 매트릭스-코팅 플레이트 상에 mTeSR 배지로 유지하였다( 재료 표 참조). 표 1 은 연구에 사용된 모든 배지 조성물을 포함하고 있다.
1. 분화 및 후방 원시 줄무늬(PS) 유도를 위한 iPSC 도금
- 멤브레인 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에서 2mL DPBS로 iPSC를 세척합니다. 피펫을 사용하여 DPBS를 흡인합니다.
- 시중에서 판매되는 세포 분리 용액( 재료 표 참조) 1mL를 추가하여 iPSC를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- iPSC에 mTeSR 1mL를 추가하고 세포가 플라스틱 표면에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
- 실온(RT)에서 3분 동안 400 x g 에서 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 멤브레인 매트릭스로 코팅된 24웰 또는 6웰 플레이트에 다양한 세포 밀도를 파종하고 10μM Rho 키나아제 억제제(Y-27632)가 보충된 mTeSR로 배양합니다( ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
IM의 생성은 GSK3 억제제 CHIR99021 사용하여 표준 WNT 신호 전달을 활성화한 후 FGF9/헤파린을 활성화하여 달성됩니다. 0일차부터 4일차까지 iPSC는 빠르게 팽창하여 능형형 또는 삼각형 모양을 취합니다. 합류점은 90%-100%에 도달하고 7일까지 고르게 축적됩니다. 현탁 배양 시 응집체는 7일째에 해리된 후 자발적으로 네프론 구조를 형성합니다. 현탁 배양을 통해 생성된 신장 오가노이드는 관형 구조를 나타내며 응집 18일 후 명시야 이미지에서 쉽게 관찰할 수 있습니다(그림 2 및 그림 3).
일반적으로 iPSC의 24웰 플레이트의 웰에서 시작하는 한 번의 분석은 200-300개의 오가노이드를 생성합니다. 이 중 80%-90%는 네프론과 유사한 구조를 포함합니다(그림 2). hiPSC-B1 iPSC 라인의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되었으며, 여기에는 기저 배지, 초기 세포 밀도 및 CHIR99021 농도에 대한 약간의 변형이 포함됩니다. 다양한 실험에서 성공적인 신장 오가노이드 생성을 위한 중요한 요소는 중간 중배엽(IM)과 7일째 세포 상태의 초기 분화인 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, 상이한 iPSC 라인은 세포 증식 및 분화 잠재력의 변화를 나타내어 최적의 세포 밀도 및 CHIR99021 농도가 다양해졌습니다 5,13,14. 따라서 각 iPSC 라인에 대한 이상적인 조건을 결정하는 것은 환자 특이적 iPSC에서 상당한 수의 신장 오가노이드를 생산하는 데 필수적입니다.
최적의 조건을 식별하려면 대규모 생산을 위해 배양을 6웰 플레이트로 확장하기 전에 24웰 플레이트를 사용하.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않았습니다.
감사의 글
우리는 과거와 현재의 모든 Mao 및 Hu Lab 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동보건임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu), 장쑤성 자연과학재단(보조금 번호. BK20210150 Gang Wang에게).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 세포 배양 플레이트, 평면 바닥 | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| 항체 | |||
| 벤질 알코올 | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| 벤질 벤조에이 | 트 Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| 생물 안전 캐비닛 | 하이얼 | 고양이 #HR40  A2 | |
| 비오틴 anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| 혈액 단핵 세포 hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| 이산화탄소 레벨 쉐이커 | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar 다중 6웰 세포 배양 플레이트 | Corning | Cat #3516 | |
| Costar 초저 부착 6웰 플레이트 | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI 염색 솔루션 | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo 과학적인 | 고양이 #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES 자유로운 | 서비스bio | 고양이 #G4610 | |
| 당나귀 반대로 양 IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| 당나귀 세럼 stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 제외) | Solarbio 생명 과학 | 고양이 #D1040 | |
| 드라이 배스 인큐베이터 | 상하이 Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488- 염소 안티 마우스 IgG (1:400) | Earthox | 고양이 #E032210 | |
| Dylight 488-염소 안티 토끼 IgG (1:400) | 어스톡 | 고양이 #E032220 | |
| 다일라이트 549-염소 안티 마우스 IgG (1:400) | 어스 | 캣 #E032310 | |
| 다이라이트 549-염소 안티 토끼 IgG (1:400) | 어톡 | 고양이 #E032320 | |
| 다일라이트 649-염소 안티 래빗 IgG (1:400) | 어톡 | 캣 #E032620 | |
| 실험 모델: 세포주 | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell Culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| 인간 재조합 FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| 도립 현미경 | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| 메틸 셀룰로오스 | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| 마이크로 원심분리기 | HENGNUO | 고양이 # 2-4B | |
| 마우스 anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | 고양이 # 555444 | |
| 마우스 anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | 고양이 # 610182 | |
| 마우스 anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| 마우스 anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo Scientific | 고양이 # 39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 기초 매체 | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube 바이알 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| 기타 | |||
| 토끼 anti-human GATA3 (1:300) | 세포 신호 전달 기술 | 고양이 #5852S | |
| 토끼 안티 휴먼 LRP2 (1:300) | 사파이어 생명 과학 | 고양이 #NBP2-39033 | |
| 토끼 안티 휴먼 Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| 토끼 안티 휴먼 WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit 안티 마우스 PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA) | YEASEN | 고양이 #20901ES03 | |
| 양 항 인간 NPHS1 (1:300) | R & D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
참고문헌
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
