Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Summary

Um procedimento para extrair DNA livre de células do humor vítreo e aquoso para realizar estudos moleculares para o diagnóstico de linfoma vitreorretiniano é estabelecido aqui. O método oferece a capacidade de extrair simultaneamente o DNA do componente celular da amostra ou reservá-lo para testes auxiliares.

Abstract

O linfoma vitreorretiniano (LVV) representa um linfoma agressivo, frequentemente categorizado como linfoma primário de grandes células B difuso do sistema nervoso central. Para o diagnóstico da LVR, são coletados espécimes como humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso. Os testes diagnósticos para VRL nesses espécimes incluem citologia, citometria de fluxo e teste molecular. No entanto, tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo, juntamente com o teste molecular usando DNA celular, necessitam de células inteiras intactas. O desafio está no fato de que o humor vítreo e aquoso normalmente tem baixa celularidade, e muitas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Além disso, esses espécimes apresentam dificuldades adicionais para testes moleculares devido à alta viscosidade do humor vítreo e ao baixo volume do humor vítreo e aquoso. Este estudo propõe um método para extração de DNA livre de células de espécimes vítreos e aquosos. Essa abordagem complementa a extração de DNA celular ou permite que o componente celular desses espécimes seja utilizado para outros métodos diagnósticos, incluindo citologia e citometria de fluxo.

Introduction

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo associado ao linfoma difuso primário de grandes células B do sistema nervoso ^central1,2,3. A VRL é tipicamente fatal devido ao seu envolvimento no sistema nervoso central ^1,2. Embora rara^1,4, a VRL frequentemente apresenta sintomas semelhantes à uveíte posterior e outras doenças vitreorretinianas4,5. Consequentemente, os pacientes que apresentam sintomas de uveíte requerem um diagnóstico para confirmar ou descartar a VRL.

Recentemente, foram publicados critérios consensuais para o diagnóstico de VRL, que envolvem uma combinação de exame clínico e achados^{laboratoriais6}. Espécimes comumente utilizados para o diagnóstico de VRL incluem humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso⁷. O humor vítreo é obtido através de um procedimento cirúrgico denominado vitrectomia pars plana, que permite o acesso ao segmento posterior do olho⁸.

No protocolo apresentado, espécimes de humor aquoso e vítreo foram coletados para extração celular e de cfDNA. Após anestesia dos pacientes e colocação de trocárteres a aproximadamente 4 mm do limbo corneano, obteve-se uma amostra de humor aquoso de aproximadamente 100-200 μL utilizando seringa tuberculínica de 1 mL no limbo corneano. Para os pacientes pseudofácicos, o vítreo não diluído foi obtido pela introdução de ar estéril na infusão, permitindo a coleta de maior quantidade de vítreo não diluído (até 3,5 mL). Em pacientes fácicos, aproximadamente 500 a 1000 μL de vítreo não diluído foram removidos antes de iniciar uma infusão de solução salina balanceada. Em alguns casos, o vítreo secundariamente diluído (500 a 2.000 μL) foi coletado trocando-se a infusão para fluido e colocando-se o vitrector dentro da saia vítrea para obter essa amostra. A fração vítrea mais diluída foi coletada preservando-se a bolsa (Figura 1 suplementar) ao final da cirurgia. Uma vez que essa bolsa chegava ao departamento de patologia, o vítreo diluído era obtido a partir da drenagem do líquido para fora dessa bolsa em tubos cônicos para posterior extração de DNA.

A citopatologia do líquido vítreo é frequentemente considerada padrão-ouro9. Entretanto, vários estudos têm demonstrado sensibilidade limitada devido ao processamento e à celularidade mínima10,11,12. A citometria de fluxo pode auxiliar na identificação de células B clonais, mas também pode ser limitada pela baixa celularidade e fragilidade das grandes células do linfoma^13,14,15. Tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo requerem células inteiras intactas. Muitas dessas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Quando o teste molecular é realizado usando DNA extraído de células intactas (DNA celular), ele sofre dessa mesma limitação. Além disso, dividir o espécime vítreo limitado para todos esses testes reduz a quantidade de material disponível para cada teste.

O DNA livre de células (cfDNA) representa outra fonte de DNA que não requer células intactas. O cfDNA de espécimes vítreos tem sido utilizado para a detecção de VRL ^16,17 e melanoma uveal¹⁸. Neste protocolo, DNA celular e livre de células são extraídos do líquido vítreo e aquoso para detectar VRL.

Protocol

O presente protocolo segue as diretrizes de cuidados humanos e com aprovação do comitê de revisão institucional (IRB) da Universidade de Michigan. Para tal, obteve-se a dispensa do termo de consentimento livre e esclarecido junto ao CEP. Não há critérios relevantes de inclusão ou exclusão para os pacientes envolvidos. 1. Separação de componentes celulares e livres de células NOTA: Três tipos de amostras podem ser recebidas para testes dia…

Representative Results

Esses métodos de extração foram realizados em um número limitado de casos para garantir o rendimento adequado e a amplificabilidade do DNA livre de células em comparação com o DNA celular dos espécimes vítreos (quatro) e aquosos (quatro). A partir dessas amostras, os rendimentos de DNA do componente livre de células desses fluidos são semelhantes aos do componente celular (Tabela 1). O DNA celular e o cfDNA dessas amostras também foram avaliados por meio de testes moleculares, como para a mut…

Discussion

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo de grandes células B ^1,2,3 cujos sintomas podem mimetizar outras doenças vitreorretinianas4,5. O teste molecular do humor vítreo e, mais recentemente, aquoso tornou-se um método crítico para fazer o diagnóstico de VRL ou descartá-lo. No entanto, esses fluidos são muito baixos em volume e muitas vezes têm b…

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010