تقنية التصور 3-D لإعادة عرض العظام في نموذج الماوس توسيع خياطة
Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع الخياطة وطريقة تصور 3-D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.
Abstract
تلعب الغرز القحفية الوجهية دورا حاسما يتجاوز كونها مفاصل ليفية تربط العظام القحفية الوجهية. كما أنها بمثابة المكانة الأساسية لنمو عظام الجلجلة والوجه ، حيث تحتوي على الخلايا الجذعية الوسيطة وأسلاف العظام. نظرا لأن معظم العظام القحفية الوجهية تتطور من خلال التعظم داخل الغشاء ، فإن المناطق الهامشية للخيوط تعمل كنقاط بدء. نظرا لهذه الأهمية ، أصبحت هذه الغرز أهدافا مثيرة للاهتمام في علاجات العظام مثل توسيع قبو الجمجمة بمساعدة الربيع ، والتوسع السريع في الفك العلوي ، وإطالة الفك العلوي. تحت قوة تتبع العظام ، يتم تنشيط الخلايا الجذعية الغرز بسرعة ، لتصبح مصدرا ديناميكيا لإعادة تشكيل العظام أثناء التوسع. على الرغم من أهميتها ، لا تزال التغيرات الفسيولوجية خلال فترات إعادة تشكيل العظام غير مفهومة بشكل جيد. طرق التقسيم التقليدية ، في المقام الأول في الاتجاه السهمي ، لا تلتقط التغييرات الشاملة التي تحدث في جميع أنحاء الخيط بأكمله. أنشأت هذه الدراسة نموذجا قياسيا للفأر لتوسيع خياطة السهمي. لتصور تغييرات إعادة تشكيل العظام بشكل كامل بعد توسع الخياطة ، تم دمج طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS مع تلطيخ EdU الكامل والملصقات المزدوجة المخلبة بالكالسيوم. سمح ذلك بتصور الخلايا المتكاثرة للغاية وتكوين عظام جديدة عبر عظام الجلاد بأكملها بعد التوسع. يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع خياطة وطريقة تصور 3-D ، مما يلقي الضوء على التغيرات الميكانيكية البيولوجية في الغرز وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.
Introduction
الغرز القحفية الوجهية هي أنسجة ليفية تربط العظام القحفية الوجهية وتلعب أدوارا أساسية في نمو وإعادة تشكيل العظام القحفية الوجهية. يشبه هيكل الخيط النهر ، حيث يوفر تدفقا لموارد الخلايا لتغذية وبناء “ضفة النهر” ، والمعروفة باسم الجبهات العظمية ، والتي تساهم في تكوين العظام القحفية الوجهية عن طريق تكوين العظم داخل الغشاء1.
كان الاهتمام بالخيوط القحفية الوجهية مدفوعا بالاحتياجات السريرية لفهم الإغلاق المبكر للخيوط القحفية وخلل خياطة الوجه ، مما قد يؤدي إلى تشوهات قحفية وجهية وحتى حالات تهدد حياة الأطفال. يستخدم استئصال الخياطة المفتوحة بشكل روتيني في العلاج السريري ، لكن المتابعة طويلة المدى أظهرت تكرار إعادة التعظم غير الكامل في بعض المرضى2. قد يوفر حج القحف طفيف التوغل بمساعدة نوابض التمدد أو استئصال القحف الشريطي بالمنظار طريقة أكثر أمانا للحفاظ على الخيط المحتمل بدلا من التخلص من الأنسجة3. وبالمثل ، تم استخدام علاجات العظام مثل أقنعة الوجه وأجهزة التوسيع على نطاق واسع لعلاج نقص تنسج الفك العلوي السهمي أو الأفقي ، مع بعض الدراسات التي تمدد الحد العمري لعلاج المرضى البالغين عبر موسعات حنكية صغيرة بمساعدة اللولب4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تجديد خياطة الجمجمة بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) جنبا إلى جنب مع المواد القابلة للتحلل هو علاج محتمل في المستقبل ، ويقدم اتجاها جديدا لعلاج الأمراض ذات الصلة7. ومع ذلك ، فإن عملية الوظيفة أو الآلية التنظيمية للخيوط الجراحية لا تزال بعيدة المنال.
تتكون إعادة تشكيل العظام بشكل أساسي من التوازن بين تكوين العظام الذي تجريه بانيات العظم وارتشاف العظام الذي تجريه الخلايا الآكلة للعظم ، حيث يلعب التمايز العظمي للخلايا الجذعية التي تحفزها الإشارات الميكانيكية دورا مهما. بعد عقود من البحث ، وجد أن الغرز القحفية الوجهية عبارة عن منافذ للخلايا الجذعية الوسيطة عالية البلاستيك8. الخلايا الجذعية المخيطة (SuSCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الجذعية ، تنتمي إلى الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) أو الخلايا الجذعية العظمية (SSCs). يتم تصنيف SuSCs في الجسم الحي بأربع علامات ، بما في ذلك Gli1 و Axin2 و Prrx1 و Ctsk. Gli1 + SuSCs ، على وجه الخصوص ، تحققت بدقة من الخصائص البيولوجية للخلايا الجذعية ، ليس فقط إظهار تعبير عال عن علامات MSC النموذجية ولكن أيضا إظهار إمكانات عظمية وغضروفية ممتازة9. أظهرت الأبحاث السابقة أن Gli1 + SuSCs تساهم بنشاط في تكوين عظام جديدة تحت قوة الشد ، وتحديدها على أنها مصدر الخلايا الجذعية للخياطة التي تدعم تكوين العظم10.
في الماضي ، تمت دراسة الخصائص الميكانيكية الواسعة للخلايا الجذعية في المختبر عبر Flexcell ، والانحناء رباعي النقاط ، ونظام تحميل المغناطيس الدقيق ، وغيرها. على الرغم من أنه تم تحديد خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من خياطة الجمجمة للفأر في المختبر11 ، كما تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مؤخرا12 ، إلا أن الاستجابة الميكانيكية الحيوية لخلايا الخياطة لا تزال غير واضحة في النظام في المختبر. لمزيد من التحقيق في عملية إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج تمدد خياطة يعتمد على ثقافة أعضاء كالفاريا المعزولة ، مما يمهد الطريق لإنشاء نموذج مفيد لتوسيع خياطة الجسم الحي 1،13. كانت الأرانب14 والفئران15 أكثر استخداما في الأبحاث الأساسية لتوسيع الخياطة. ومع ذلك ، فإن الفئران هي نماذج حيوانية مفضلة لاستكشاف الأمراض البشرية بسبب جينومها المتماثل للغاية مع البشر ، والعديد من خطوط تعديل الجينات ، وقدرة التهجين الإنجابية القوية. تعتمد نماذج الماوس الحالية لتوسيع خياطة الجمجمة عادة على أسلاك زنبركية تقويم الأسنان المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتطبيق قوة الشد على الخيط السهمي16,17. في هذه النماذج ، يتم عمل فتحتين في كل جانب من العظام الجدارية لإصلاح جهاز التمدد ، ويتم تضمين الأسلاك تحت الجلد ، مما قد يؤثر على وضع تنشيط الخلية.
فيما يتعلق بطريقة التصور ، تم اعتماد الملاحظة ثنائية الأبعاد للشرائح في الاتجاه السهمي بشكل عام لعقود. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن إعادة تشكيل العظام هي عملية ديناميكية ثلاثية الأبعاد معقدة ، أصبح الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد كاملة حاجة ملحة. ظهرت تقنية شفافية الأنسجة PEGASOS لتلبية هذا المطلب18,19. إنه يوفر مزايا فريدة لشفافية الأنسجة الصلبة والرخوة ، مما يتيح إعادة إنتاج عملية إعادة تشكيل العظام الكاملة في مساحة ثلاثية الأبعاد.
للحصول على فهم أعمق وأكثر شمولا للتغيرات الفسيولوجية في فترات إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج فأر قياسي لتوسيع خياطة السهمي مع إعداد زنبركي بين حاملات مصنوعة يدويا10. من خلال إجراء النقش والترابط الحمضي القياسي ، يمكن ربط جهاز التمدد بقوة بعظم الجمجمة ، مما يولد قوة شد عمودية على الخيط السهمي. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طريقة PEGASOS لإزالة الأنسجة بعد وضع العلامات المزدوجة على العظام المعدنية بعد التمدد لتصور تغييرات نمذجة العظام بشكل كامل بعد تمدد الخياطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطبيق نموذج ماوس تمدد خياطة قياسي لمراقبة التغيرات المورفولوجية المنتظمة التي تحدث كل أسبوع خلال دورة إعادة العرض10 التي تستغرق شهرا كاملا. هذا النموذج مفيد للبحث في إعادة تشكيل العظام القلوية وتجديدها عن طريق توسيع الغرز الكالفارية ، وكذلك لدراسة خلايا خياطة مختلفة <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر منصة المختبر ومساعدة معهد الأذن ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج شنغهاي بوجيانغ (22PJ1409200) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 11932012) ؛ مؤسسة البحث العلمي لما بعد الدكتوراه في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ تمويل برنامج البحوث الأساسية لمستشفى الشعب التاسع التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
