En 3D-visualiseringsteknik til knoglemodellering i en suturudvidelsesmusemodel

Summary

Denne protokol præsenterer en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode til at studere de mekanobiologiske ændringer af sutur og knoglemodellering under trækkraftbelastning.

Abstract

Kraniofaciale suturer spiller en afgørende rolle ud over at være fibrøse led, der forbinder kraniofaciale knogler; De tjener også som den primære niche for calvarial og facial knoglevækst, der huser mesenkymale stamceller og osteoprogenitorer. Da de fleste kraniofaciale knogler udvikler sig gennem intramembranøs ossifikation, fungerer suturernes marginale regioner som initieringspunkter. På grund af denne betydning er disse suturer blevet spændende mål i ortopædiske terapier som fjederassisteret kraniehvelvudvidelse, hurtig maksillær ekspansion og maksillær protraktion. Under ortopædisk sporingskraft aktiveres suturstamceller hurtigt og bliver en dynamisk kilde til knoglemodellering under ekspansion. På trods af deres betydning forbliver de fysiologiske ændringer under knoglemodelleringsperioder dårligt forstået. Traditionelle sektioneringsmetoder, primært i sagittal retning, fanger ikke de omfattende ændringer, der forekommer gennem hele suturen. Denne undersøgelse etablerede en standard musemodel for sagittal suturudvidelse. For fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringer efter suturudvidelse blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden kombineret med helmonteret EdU-farvning og calciumchelaterende dobbeltmærkning. Dette muliggjorde visualisering af stærkt prolifererende celler og ny knogledannelse på tværs af hele calvariale knogler efter ekspansion. Denne protokol tilbyder en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode, der kaster lys over de mekanobiologiske ændringer i suturer og knoglemodellering under trækkraftbelastning.

Introduction

Kraniofacial suturer er fibrøst væv, der forbinder kraniofaciale knogler og spiller vigtige roller i vækst og ombygning af kraniofaciale knogler. Suturens struktur ligner en flod, der giver en strøm af celleressourcer til at nære og opbygge “flodbredden”, kendt som de osteogene fronter, som bidrager til dannelsen af kraniofaciale knogler via intramembranøs osteogenese¹.

Interessen for kraniofaciale suturer har været drevet af kliniske behov for at forstå for tidlig lukning af kraniesuturer og ansigtssuturdysfunktion, hvilket kan føre til kraniofaciale deformiteter og endda livstruende tilstande hos børn. Åben suturektomi anvendes rutinemæssigt i klinisk behandling, men langvarig opfølgning har vist ufuldstændig re-ossifikation tilbagefald hos nogle patienter². Minimalt invasiv kraniotomi assisteret af ekspansionsfjedre eller endoskopisk stribe kraniektomi kan give en sikrere tilgang til at bevare den potentielle sutur snarere end at kassere vævene³. Tilsvarende har ortopædiske terapier såsom ansigtsmasker og ekspansionsapparater været meget udbredt til behandling af sagittal eller vandret maksillær hypoplasi, hvor nogle undersøgelser udvider aldersbegrænsningen til behandling af voksne patienter via miniscrew-assisterede palatale ekspandere ^4,5,6. Derudover er kranial suturregenerering med mesenkymale stamceller (MSC’er) kombineret med biologisk nedbrydelige materialer en potentiel terapi i fremtiden, der tilbyder en ny retning for behandling af relaterede sygdomme⁷. Imidlertid forbliver funktionsprocessen eller reguleringsmekanismen for suturer undvigende.

Knoglemodellering består hovedsageligt af en balance mellem knogledannelse udført af osteoblaster og knogleresorption udført af osteoklaster, hvor osteogen differentiering af stamceller stimuleret af mekaniske signaler spiller en vigtig rolle. Efter årtiers forskning har det vist sig, at kraniofaciale suturer er meget plastiske mesenkymale stamcellenicher⁸. Suturstamceller (SuSC’er) er en heterogen gruppe af stamceller, der tilhører mesenkymale stamceller (MSC’er) eller knoglestamceller (SSC’er). SuSC’er er mærket in vivo med fire markører, herunder Gli1, Axin2, Prrx1 og Ctsk. Især Gli1⁺ SuSC’er har nøje verificeret stamcellernes biologiske egenskaber og udviser ikke kun høj ekspression af typiske MSC-markører, men viser også fremragende osteogent og kondrogent potentiale⁹. Tidligere forskning har vist, at Gli1⁺ SuSC’er aktivt bidrager til ny knogledannelse under trækkraft og identificerer dem som suturstamcellekilden, der understøtter distraktionsosteogenese¹⁰.

Tidligere blev omfattende mekaniske egenskaber ved stamceller undersøgt in vitro via Flexcell, firepunktsbøjning, mikromagnetbelastningssystem og andre. Selvom mesenkymale celler afledt af mus er blevet identificeret in vitro¹¹, og humane suturmesenkymale stamceller også er blevet isoleret for nylig¹², forbliver suturcellernes biomekaniske respons uklar i in vitro-systemet. For yderligere at undersøge knoglemodelleringsprocessen er der etableret en suturudvidelsesmodel baseret på isoleret calvaria-organkultur, hvilket baner vejen for etablering af en nyttig in vivo-suturudvidelsesmodel ^1,13. Kaniner¹⁴ og rotter¹⁵ har været de mest anvendte dyr i grundforskning til suturudvidelse. Imidlertid er mus foretrukne dyremodeller til at udforske menneskelig sygdom på grund af deres meget homologe genom med mennesker, adskillige genmodifikationslinjer og stærk reproduktiv hybridiseringsevne. Eksisterende musemodeller af kranial suturudvidelse er typisk afhængige af ortodontiske fjedertråde i rustfrit stål for at påføre trækkraft på sagittalsuturen ^16,17. I disse modeller er der lavet to huller i hver side af parietalbenene for at fastgøre ekspansionsanordningen, og ledningerne er indlejret under huden, hvilket kan påvirke celleaktiveringstilstanden.

Med hensyn til visualiseringsmetoden er den todimensionelle observation af skiver i sagittal retning generelt blevet vedtaget i årtier. I betragtning af at knoglemodellering er en kompleks tredimensionel dynamisk proces, er opnåelse af komplet tredimensionel information imidlertid blevet et presserende behov. PEGASOS-vævsgennemsigtighedsteknikken opfyldte dette krav^18,19. Det giver unikke fordele for gennemsigtigheden af hårdt og blødt væv, hvilket gør det muligt at reproducere den komplette knoglemodelleringsproces i tredimensionelt rum.

For at få en dybere og mere omfattende forståelse af de fysiologiske ændringer i knogleremodelleringsperioderne blev der etableret en standard sagittal suturudvidelsesmusemodel med en fjederindstilling mellem de håndlavede holdere¹⁰. Med en standardiseret syreætsnings- og bindingsprocedure kunne ekspansionsanordningen være fast bundet til kraniebenet og generere en trækkraft vinkelret på sagittalsuturen. Desuden blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden anvendt efter dobbeltmærkning af den mineraliserede knogle efter ekspansion for fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringerne efter suturudvidelse.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Animal Care Committee of Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). 4 uger gamle C57BL/6 hanmus blev anvendt i denne undersøgelse. Alle de anvendte instrumenter blev steriliseret før proceduren. 1. Forberedelse af suturudvidelsesmodellen Forberedelse af to retentionsindehavere.Brug 0,014 ” australsk tråd eller rustfrit stål…

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol er der etableret en musemodel til sagittal suturudvidelse (figur 1-2). Til 3D-visualisering af knoglemodelleringsændringer efter suturudvidelse blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden anvendt på hele calvariale knogler efter ekspansion. Efter perfusion blev calvariale knogler adskilt (figur 3A), og den relevante PEGASOS-proces blev fortsat (tabel 1 og tabel 2). Bemærke…

Discussion

Vi anvendte en standard suturudvidelsesmusemodel til at observere de regelmæssige morfologiske ændringer, der opstår hver uge i hele den månedlange ombygningscyklus¹⁰. Denne model er nyttig til forskning i calvarial knoglemodellering og regenerering ved at udvide calvariale suturer samt til at studere forskellige suturceller in vivo. For fuldt ud at præsentere resultaterne af sådan forskning er der behov for tredimensionel visualisering af farvede væv. Derfor blev PEGASOS-teknologi…

Materials

37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027