縫合糸拡張マウスモデルにおける骨リモデリングのための3次元可視化技術

Summary

このプロトコルは、標準化された縫合糸拡張マウスモデルと3D視覚化方法を示し、引張力負荷下での縫合糸の機械生物学的変化と骨のリモデリングを研究します。

Abstract

頭蓋顔面縫合糸は、頭蓋顔面骨をつなぐ線維性関節であるだけでなく、重要な役割を果たします。また、頭蓋骨や顔面骨の成長のための主要なニッチとして機能し、間葉系幹細胞や骨前駆細胞を収容しています。ほとんどの頭蓋顔面骨は膜内骨化によって発達するため、縫合糸の辺縁領域が開始点として機能します。この重要性から、これらの縫合糸は、バネによる頭蓋骨丸天井の拡張、急速な上顎の拡張、上顎の伸展などの整形外科治療において興味深い標的となっています。整形外科のトレース力の下で、縫合糸幹細胞は急速に活性化され、拡張中の骨リモデリングの動的なソースになります。その重要性にもかかわらず、骨リモデリング期間中の生理学的変化は十分に理解されていないままです。従来の切片作成法は、主に矢状方向では、縫合糸全体で発生する包括的な変化を捉えることができません。この研究は、矢状縫合糸拡張の標準的なマウスモデルを確立しました。縫合糸拡張後の骨リモデリングの変化を完全に可視化するために、PEGASOS組織透明化法をホールマウントEdU染色およびカルシウムキレート二重標識と組み合わせました。これにより、高度に増殖する細胞と、拡張後の頭蓋骨全体にわたる新しい骨形成を可視化することができました。このプロトコルは、標準化された縫合糸拡張マウスモデルと3D可視化法を提供し、引張力負荷下での縫合糸と骨リモデリングの機械生物学的変化に光を当てます。

Introduction

頭蓋顔面縫合糸は、頭蓋顔面骨をつなぐ線維組織であり、頭蓋顔面骨の成長とリモデリングに重要な役割を果たします。縫合糸の構造は川に似ており、膜内骨形成を介して頭蓋顔面骨の形成に寄与する骨形成前線として知られる「川岸」に栄養を与えて構築するための細胞資源の流れ^{を提供します1。}

頭蓋顔面縫合糸への関心は、頭蓋縫合糸の早期閉鎖と顔面縫合機能障害を理解したいという臨床的ニーズによって推進されてきました。開腹縫合糸切除術は臨床治療で日常的に使用されていますが、長期追跡により、一部の患者で不完全な再骨化の再発が示されています²。拡張スプリングまたは内視鏡的ストライプ頭蓋切除術による低侵襲開頭術は、組織を廃棄するよりも、潜在的な縫合糸を保存するためのより安全なアプローチを提供する^{可能性があります3。}同様に、フェイスマスクや拡張器具などの整形外科的治療は、矢状または水平上顎形成不全の治療に広く使用されており、いくつかの研究では、年齢制限を延長して、ミニスクリュー支援口蓋エキスパンダーを介して成人患者を治療しています^4,5,6。さらに、間葉系幹細胞(MSC)と生分解性材料を組み合わせた頭蓋縫合糸再生は、将来の潜在的な治療法であり、関連疾患の治療に新しい方向性を提供します⁷。しかし、縫合糸の機能過程や調節機構は、いまだに解明されていない。

骨リモデリングは、主に骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスから成り立っており、力学的信号によって刺激された幹細胞の骨分化が重要な役割を果たします。何十年にもわたる研究の結果、頭蓋顔面縫合糸は高度に可塑性の間葉系幹細胞のニッチであることが判明しました⁸。縫合幹細胞(SuSC)は、間葉系幹細胞(MSC)または骨幹細胞(SSC)に属する幹細胞の不均一なグループです。SuSCは、Gli1、Axin2、Prrx1、Ctskの4つのマーカーによって in vivo で標識されています。 特にGli1⁺ SuSCは、幹細胞の生物学的特性を厳密に検証しており、典型的なMSCマーカーの高い発現を示すだけでなく、優れた骨形成能および軟骨形成能も示しています⁹。これまでの研究では、Gli1⁺ SuSCが引張力下での新しい骨形成に積極的に寄与していることが示されており、伸展骨形成をサポートする縫合糸幹細胞源として特定されています¹⁰。

過去には、幹細胞の広範な機械的特性が、Flexcell、4点曲げ、マイクロマグネットローディングシステムなどを介してin vitroで研究されていました。マウスの頭蓋縫合糸由来の間葉系細胞がin vitroで同定され¹¹、ヒト縫合糸間葉系幹細胞も最近単離された¹²が、in vitro系では縫合糸細胞の生体力学的応答は不明のままである。骨リモデリングプロセスをさらに調査するために、単離された頭蓋骨器官培養に基づく縫合糸拡張モデルが確立され、有用なin vivo縫合糸^{拡張モデルを確立する}ための道が開かれました^1,13。ウサギ¹⁴およびラット¹⁵は、縫合糸拡張のための基礎研究において最も広く用いられている動物である。しかし、マウスは、ヒトとの相同性の高いゲノム、多数の遺伝子改変系統、および強力な生殖ハイブリダイゼーション能力により、ヒト疾患を探索するための好ましい動物モデルです。頭蓋縫合糸拡張の既存のマウスモデルは、典型的には、矢状縫合糸に引張力を加えるためにステンレス鋼の歯列矯正スプリングワイヤーに依存している^16,17。これらのモデルでは、拡張装置を固定するために頭頂骨の両側に2つの穴が開けられ、ワイヤーが皮膚の下に埋め込まれているため、細胞活性化モードに影響を与える可能性があります。

可視化法に関しては、矢状方向のスライスの2次元観察が数十年にわたって一般的に採用されてきました。しかし、骨のリモデリングが複雑な3次元の動的プロセスであることを考えると、完全な3次元情報を取得することが急務となっています。PEGASOS組織透明技術は、この要件を満たすために登場しました^18,19。硬組織と軟組織の透明性に独自の利点があり、完全な骨リモデリングプロセスを3次元空間で再現することができます。

骨リモデリング期間の生理学的変化をより深く、より包括的に理解するために、手作りのホルダー間にバネをセットした標準的な矢状縫合糸拡張マウスモデルが確立されました¹⁰。標準化された酸エッチングおよび接着手順により、拡張装置を頭蓋骨にしっかりと接着し、矢状縫合糸に垂直な引張力を発生させることができました。さらに、PEGASOS組織透明化法は、縫合糸拡張後の骨モデリングの変化を完全に視覚化するために、拡張後の石灰化骨の二重標識後に適用されました。

Protocol

ここで説明するすべての実験手順は、上海交通大学医学部上海第九人民病院の動物管理委員会によって承認されました(SH9H-2023-A616-SB)。この研究では、4週齢のC57BL/6雄マウスを使用しました。使用した器具はすべて、手順の前に滅菌されました。 1. 縫合糸拡張モデルの準備 2つの保持ホルダーの準備。0.014インチのオーストラリア線またはステン?…

Representative Results

このプロトコルを用いて、矢状縫合糸拡張のマウスモデルが確立されました(図1-2)。縫合糸拡張後の骨モデリング変化を3D可視化するために、PEGASOS組織透明化法を拡張後の頭蓋骨全体に適用しました。灌流後、頭蓋骨を分離し(図3A)、適切なPEGASOSプロセスを継続した(表1および表2)。驚くべきことに…

Discussion

標準的な縫合糸拡張マウスモデルを適用して、1ヶ月のリモデリングサイクル全体を通して毎週起こる規則的な形態学的変化を観察した¹⁰。このモデルは、頭蓋骨縫合糸の拡張による頭蓋骨のリモデリングや再生の研究や、生体内の様々な縫合細胞の研究に有用です。このような研究成果を十分に提示するためには、染色された組織の3次元可視化が必要です。したがっ…

Materials

37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027