Técnica de visualização 3D para remodelação óssea em modelo de sutura em camundongo expansor

Summary

Este protocolo apresenta um modelo padronizado de flexão de sutura em camundongo e um método de visualização 3D para estudar as alterações mecanobiológicas da sutura e remodelação óssea sob carga de força de tração.

Abstract

As suturas craniofaciais desempenham um papel crucial além de serem articulações fibrosas conectando ossos craniofaciais; Eles também servem como nicho primário para o crescimento ósseo da calota e da face, abrigando células-tronco mesenquimais e osteoprogenitores. Como a maioria dos ossos craniofaciais se desenvolve através da ossificação intramembranosa, as regiões marginais das suturas atuam como pontos de iniciação. Devido a essa importância, essas suturas tornaram-se alvos intrigantes em terapias ortopédicas como expansão de abóbada craniana assistida por mola, expansão rápida da maxila e protração maxilar. Sob a força do traçado ortopédico, as células-tronco de sutura são rapidamente ativadas, tornando-se uma fonte dinâmica para a remodelação óssea durante a expansão. Apesar de sua importância, as alterações fisiológicas durante os períodos de remodelação óssea permanecem pouco compreendidas. Os métodos tradicionais de seccionamento, principalmente no sentido sagital, não captam as mudanças abrangentes que ocorrem ao longo de toda a sutura. Este estudo estabeleceu um modelo padrão de camundongo para expansão da sutura sagital. Para visualizar completamente as alterações da remodelação óssea após a expansão da sutura, o método de limpeza tecidual PEGASOS foi combinado com coloração de EdU de montagem total e dupla marcação quelante de cálcio. Isso permitiu a visualização de células altamente proliferantes e nova formação óssea em todo o osso da calota craniana após a expansão. Este protocolo oferece um modelo padronizado de mouse expansor de sutura e um método de visualização 3D, esclarecendo as mudanças mecanobiológicas nas suturas e na remodelação óssea sob carga de força de tração.

Introduction

As suturas craniofaciais são tecidos fibrosos que conectam os ossos craniofaciais e desempenham papéis essenciais no crescimento e remodelação dos ossos craniofaciais. A estrutura da sutura assemelha-se a um rio, proporcionando um fluxo de recursos celulares para nutrir e construir a “margem do rio”, conhecidas como frentes osteogênicas, que contribuem para a formação dos ossos craniofaciais via osteogênese intramembranosa1.

O interesse em suturas craniofaciais tem sido impulsionado pela necessidade clínica de entender o fechamento prematuro de suturas cranianas e a disfunção da sutura facial, que podem levar a deformidades craniofaciais e até mesmo condições com risco de vida em crianças. A suturectomia aberta é rotineiramente utilizada no tratamento clínico, mas o seguimento em longo prazo tem mostrado recorrência incompleta da reossificação em alguns pacientes². A craniotomia minimamente invasiva assistida por molas expansoras ou craniectomia endoscópica por listras pode proporcionar uma abordagem mais segura para preservar a sutura potencial em vez de descartar os tecidos³. Da mesma forma, terapias ortopédicas como máscaras faciais e expansores têm sido amplamente utilizadas no tratamento da hipoplasia sagital ou horizontal da maxila, com alguns estudos ampliando a limitação de idade para tratar pacientes adultos por meio de expansores palatinos assistidos por mini-parafuso4,5,6. Além disso, a regeneração da sutura craniana com células-tronco mesenquimais (CTMs) combinada com materiais biodegradáveis é uma terapia potencial no futuro, oferecendo uma nova direção para o tratamento de doenças^{relacionadas7}. No entanto, o processo de função ou mecanismo regulatório das suturas permanece indefinido.

A remodelação óssea consiste principalmente em um equilíbrio entre a formação óssea conduzida por osteoblastos e a reabsorção óssea conduzida por osteoclastos, onde a diferenciação osteogênica de células-tronco estimuladas por sinais mecânicos desempenha um papel importante. Após décadas de pesquisa, verificou-se que as suturas craniofaciais são nichos de células-tronco mesenquimais altamente^plásticas8. As células-tronco de sutura (SuSCs) são um grupo heterogêneo de células-tronco, pertencentes às células-tronco mesenquimais (CTMs) ou células-tronco ósseas (CTEs). SuSCs são marcados in vivo por quatro marcadores, incluindo Gli1, Axin2, Prrx1 e Ctsk. SuSCs Gli1⁺ , em particular, têm verificado rigorosamente as características biológicas de células-tronco, não apenas exibindo alta expressão de marcadores típicos de CTM, mas também demonstrando excelente potencial osteogênico e condrogênico⁹. Pesquisas anteriores mostraram que as SuSCs Gli1⁺ contribuem ativamente para a formação de novos ossos sob força de tração, identificando-os como a fonte de células-tronco de sutura que suportam a distração osteogênica¹⁰.

No passado, extensas características mecânicas de células-tronco foram estudadas in vitro via Flexcell, flexão de quatro pontos, sistema de carregamento de microímãs, entre outros. Embora células mesenquimais derivadas da sutura craniana de camundongos tenham sido identificadas in vitro¹¹ e células-tronco mesenquimais de sutura humana também tenham sido isoladas recentemente¹², a resposta biomecânica das células de sutura permanece obscura no sistema in vitro. Para investigar melhor o processo de remodelação óssea, um modelo de expansão de sutura baseado em cultura de órgãos isolados da calvária foi estabelecido, abrindo caminho para o estabelecimento de um modelo útil de expansão de sutura in vivo ^1,13. Coelhos¹⁴ e ratos¹⁵ têm sido os animais mais utilizados em pesquisa básica para expansão de sutura. No entanto, camundongos são modelos animais preferidos para explorar doenças humanas devido ao seu genoma altamente homólogo com humanos, numerosas linhas de modificação gênica e forte capacidade de hibridização reprodutiva. Os modelos existentes de expansão de sutura craniana em camundongos tipicamente dependem de fios de mola ortodôntica de aço inoxidável para aplicar força de tração na sutura sagital^16,17. Nesses modelos, são feitos dois orifícios em cada lado dos ossos parietais para fixar o dispositivo de expansão, e os fios são embutidos sob a pele, o que pode afetar o modo de ativação celular.

Em relação ao método de visualização, a observação bidimensional de cortes no sentido sagital tem sido geralmente adotada há décadas. Entretanto, considerando que a remodelação óssea é um processo dinâmico tridimensional complexo, a obtenção de informações tridimensionais completas tornou-se uma necessidade urgente. A técnica de transparência tecidual PEGASOS surgiu para atender a esse requisito^18,19. Oferece vantagens únicas pela transparência dos tecidos duros e moles, permitindo que todo o processo de remodelação óssea seja reproduzido no espaço tridimensional.

Para obter uma compreensão mais profunda e abrangente das alterações fisiológicas nos períodos de remodelação óssea, foi estabelecido um modelo padrão de camundongo expansor de sutura sagital com fixação de mola entre os suportes^artesanais10. Com um procedimento padronizado de condicionamento ácido e colagem, o dispositivo expansor poderia ser firmemente colado ao osso craniano, gerando uma força de tração perpendicular à sutura sagital. Além disso, o método PEGASOS tissue clearing foi aplicado após dupla marcação do osso mineralizado pós-expansão para visualizar completamente as mudanças na modelagem óssea após a expansão da sutura.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do Shanghai Nono People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). Camundongos C57BL/6 machos com 4 semanas de idade foram usados neste estudo. Todos os instrumentais utilizados foram esterilizados previamente ao procedimento. 1. Preparo do modelo de expansão da sutura Preparação de dois detentores de retenção.Us…

Representative Results

Com esse protocolo, foi estabelecido um modelo de camundongo para expansão da sutura sagital (Figura 1-2). Para a visualização em 3D das mudanças na modelagem óssea após a expansão da sutura, o método PEGASOS tissue clearing foi aplicado em todo o osso da calota craniana após a expansão. Após a perfusão, os ossos da calota craniana foram separados (Figura 3A) e o processo PEGASOS adequado foi continuado (Tabe…

Discussion

Aplicamos um modelo padrão de camundongo expansor de sutura para observar as mudanças morfológicas regulares que ocorrem a cada semana durante todo o ciclo de remodelação de um mês¹⁰. Este modelo é útil para pesquisar a remodelação e regeneração óssea da calota craniana através da expansão de suturas de calvárias, bem como para estudar várias células de sutura in vivo. Para apresentar os resultados desta pesquisa, é necessária a visualização tridimensional dos tecido…

Materials

37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027