Una técnica de visualización en 3D para la remodelación ósea en un modelo de ratón de expansión de sutura

Summary

Este protocolo presenta un modelo de ratón estandarizado de expansión de sutura y un método de visualización 3D para estudiar los cambios mecanobiológicos de la sutura y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.

Abstract

Las suturas craneofaciales juegan un papel crucial más allá de ser articulaciones fibrosas que conectan los huesos craneofaciales; También sirven como nicho principal para el crecimiento de los huesos del calvario y la cara, albergando células madre mesenquimales y osteoprogenitores. Como la mayoría de los huesos craneofaciales se desarrollan a través de la osificación intramembranosa, las regiones marginales de las suturas actúan como puntos de iniciación. Debido a esta importancia, estas suturas se han convertido en objetivos intrigantes en terapias ortopédicas como la expansión de la bóveda craneal asistida por resorte, la expansión maxilar rápida y la protracción maxilar. Bajo la fuerza de trazado ortopédico, las células madre de sutura se activan rápidamente, convirtiéndose en una fuente dinámica para la remodelación ósea durante la expansión. A pesar de su importancia, los cambios fisiológicos durante los períodos de remodelación ósea siguen siendo poco conocidos. Los métodos tradicionales de corte, principalmente en la dirección sagital, no capturan los cambios integrales que ocurren a lo largo de toda la sutura. Este estudio estableció un modelo estándar de ratón para la expansión de la sutura sagital. Para visualizar completamente los cambios de remodelación ósea después de la expansión de la sutura, el método de limpieza de tejido PEGASOS se combinó con tinción de EdU de montaje completo y doble marcaje quelante de calcio. Esto permitió la visualización de células altamente proliferantes y la formación de hueso nuevo en todos los huesos del calvario después de la expansión. Este protocolo ofrece un modelo de ratón de expansión de sutura estandarizado y un método de visualización en 3D, que arroja luz sobre los cambios mecanobiológicos en las suturas y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.

Introduction

Las suturas craneofaciales son tejidos fibrosos que conectan los huesos craneofaciales y desempeñan un papel esencial en el crecimiento y la remodelación de los huesos craneofaciales. La estructura de la sutura se asemeja a un río, proporcionando un flujo de recursos celulares para nutrir y construir la “orilla del río”, conocidos como frentes osteogénicos, que contribuyen a la formación de huesos craneofaciales a través de la osteogénesis intramembranosa¹.

El interés en las suturas craneofaciales ha sido impulsado por las necesidades clínicas de comprender el cierre prematuro de las suturas craneales y la disfunción de la sutura facial, que puede conducir a deformidades craneofaciales e incluso afecciones potencialmente mortales en los niños. La suturectomía abierta se utiliza de forma rutinaria en el tratamiento clínico, pero el seguimiento a largo plazo ha demostrado una recurrencia incompleta de la reosificación en algunos pacientes². La craneotomía mínimamente invasiva asistida por resortes de expansión o la craniectomía endoscópica con rayas puede proporcionar un enfoque más seguro para preservar la sutura potencial en lugar de descartar los tejidos³. Del mismo modo, las terapias ortopédicas, como las mascarillas y los aparatos de expansión, han sido ampliamente utilizadas para tratar la hipoplasia maxilar sagital u horizontal, y algunos estudios han ampliado la limitación de edad para tratar a pacientes adultos mediante expansores palatinos asistidos por minitornillos ^4,5,6. Además, la regeneración de la sutura craneal con células madre mesenquimales (MSC) combinadas con materiales biodegradables es una terapia potencial en el futuro, que ofrece una dirección novedosa para el tratamiento de enfermedades relacionadas⁷. Sin embargo, la función, el proceso o mecanismo regulador de las suturas sigue siendo difícil de alcanzar.

El remodelado óseo consiste principalmente en un equilibrio entre la formación ósea realizada por los osteoblastos y la resorción ósea realizada por los osteoclastos, donde la diferenciación osteogénica de las células madre estimuladas por señales mecánicas juega un papel importante. Después de décadas de investigación, se ha encontrado que las suturas craneofaciales son nichos de células madre mesenquimales altamente plásticas⁸. Las células madre de sutura (SuSC) son un grupo heterogéneo de células madre, pertenecientes a las células madre mesenquimales (MSC) o a las células madre óseas (SSC). Las SuSC se marcan in vivo mediante cuatro marcadores, que incluyen Gli1, Axin2, Prrx1 y Ctsk. Las SuSC Gli1⁺ , en particular, han verificado estrictamente las características biológicas de las células madre, no solo exhibiendo una alta expresión de marcadores típicos de MSC, sino que también demostrando un excelente potencial osteogénico y condrogénico⁹. Investigaciones anteriores han demostrado que los SuSC Gli1⁺ contribuyen activamente a la formación de hueso nuevo bajo la fuerza de tracción, identificándolos como la fuente de células madre de sutura que apoyan la osteogénesis por distracción¹⁰.

En el pasado, se estudiaron in vitro extensas características mecánicas de las células madre a través de Flexcell, flexión de cuatro puntos, sistema de carga de microimanes y otros. Aunque se han identificado in vitro células mesenquimales derivadas de suturas craneales ^{de ratón 11}, y recientemente también se han aislado células madre mesenquimales de sutura humana¹², la respuesta biomecánica de las células de sutura sigue sin estar clara en el sistema in vitro. Para profundizar en el proceso de remodelación ósea, se ha establecido un modelo de expansión de sutura basado en el cultivo aislado de órganos de la calvaria, allanando el camino para establecer un modelo de expansión de sutura útil in vivo ^1,13. Los conejos¹⁴ y las ratas¹⁵ han sido los animales más utilizados en la investigación básica para la expansión de las suturas. Sin embargo, los ratones son los modelos animales preferidos para explorar enfermedades humanas debido a su genoma altamente homólogo con los humanos, numerosas líneas de modificación genética y una fuerte capacidad de hibridación reproductiva. Los modelos de ratón existentes de expansión de la sutura craneal suelen basarse en alambres de resorte de ortodoncia de acero inoxidable para aplicar fuerza de tracción a la sutura sagital^16,17. En estos modelos, se hacen dos orificios a cada lado de los huesos parietales para fijar el dispositivo de expansión, y los cables se incrustan debajo de la piel, lo que puede afectar el modo de activación celular.

En cuanto al método de visualización, la observación bidimensional de cortes en la dirección sagital se ha adoptado generalmente durante décadas. Sin embargo, teniendo en cuenta que el remodelado óseo es un proceso dinámico tridimensional complejo, la obtención de información tridimensional completa se ha convertido en una necesidad urgente. La técnica de transparencia tisular PEGASOS surgió para cumplir con este requerimiento^18,19. Ofrece ventajas únicas para la transparencia de los tejidos duros y blandos, lo que permite reproducir el proceso completo de remodelación ósea en un espacio tridimensional.

Para obtener una comprensión más profunda y completa de los cambios fisiológicos en los períodos de remodelación ósea, se estableció un modelo estándar de ratón de expansión de sutura sagital con un ajuste de resorte entre los soportes hechos a mano¹⁰. Con un procedimiento estandarizado de grabado y unión con ácido, el dispositivo de expansión podría adherirse firmemente al hueso craneal, generando una fuerza de tracción perpendicular a la sutura sagital. Además, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS después del doble marcaje del hueso mineralizado después de la expansión para visualizar completamente los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (SH9H-2023-A616-SB). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 4 semanas de edad. Todos los instrumentos utilizados fueron esterilizados antes del procedimiento. 1. Elaboración del modelo de expansión de sutura Preparación de dos soportes …

Representative Results

Utilizando este protocolo, se ha establecido un modelo de ratón para la expansión de la sutura sagital (Figura 1-2). Para la visualización en 3D de los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS a todos los huesos del calvario después de la expansión. Después de la perfusión, se separaron los huesos del calvario (Figura 3A) y se continuó con el…

Discussion

Se aplicó un modelo de ratón de expansión de sutura estándar para observar los cambios morfológicos regulares que ocurren cada semana durante todo el ciclo de remodelación de un mes de duración¹⁰. Este modelo es útil para investigar la remodelación y regeneración ósea del calvario mediante la expansión de las suturas del calvario, así como para estudiar varias células de sutura in vivo. Para presentar completamente los resultados de dicha investigación, se necesita una visu…

Materials

37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027