Tidlig uguidet menneskelig hjerneorganoid neurovaskulær nichemodellering i den tilladende chick embryo chorioallantoic membran
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at indpode menneskelige hjerneorganoider på flere modningsstadier i kyllingens chorioallantoiske membran (CAM). Hjerneorganoider blev dyrket efter uguidede standardiserede protokoller.
Abstract
Indpodning af organoider i vaskulariseret væv i modeldyr, såsom immundefekt mus eller kyllingembryo chorioallantoic membran (CAM), har vist sig effektiv til neovaskulariseringsmodellering. CAM er en rigt vaskulariseret ekstraembryonisk membran, som viser begrænset immunreaktivitet og dermed bliver en fremragende værtsmodel for celletransplantationer af human oprindelse.
Dette papir beskriver strategien til at indpode menneskelige hjerneorganoider, der er differentieret på flere modningsstadier, i CAM. Den cellulære sammensætning af hjerneorganoider ændrer sig med tiden, hvilket afspejler milepælene i den menneskelige hjerneudvikling. Vi podede hjerneorganoider på relevante modningsstadier: neuroepitelekspansion (18 DIV), tidlig neurogenese (60 DIV) og tidlig gliogenese (180 DIV) i CAM af embryonale dag (E) 7 kyllingeembryoner. Indpodede hjerneorganoider blev høstet 5 dage senere, og deres histologiske egenskaber blev analyseret.
Der blev ikke påvist histologiske tegn på neovaskularisering i de podede organoider eller unormale blodkar ved siden af podningerne. Desuden blev der observeret bemærkelsesværdige ændringer i den cellulære sammensætning af de podede organoider, nemlig en stigning i antallet af gliafibrillære sure protein-positive-reaktive astrocytter. De cytoarkitektoniske ændringer var imidlertid afhængige af organoidmodningsstadiet. Alt i alt tyder disse resultater på, at hjerneorganoider kan vokse i CAM, og de viser forskelle i cytoarkitekturen afhængigt af deres modningsstadium ved podning.
Introduction
Menneskelige hjerneorganoider er en ny teknik, der giver os mulighed for at rekapitulere den tidlige udvikling af den menneskelige hjerne in vitro 1,2,3. Ikke desto mindre er en af de største begrænsninger ved denne model manglen på vaskularisering, som spiller uundværlige roller ikke kun i hjernens homeostase, men også i hjernens udvikling4. Ud over levering af ilt og næringsstoffer tyder akkumulerende beviser på, at hjernens vaskulære system regulerer neural differentiering, migration og synaptogenese under udvikling 5,6. Derfor er der et presserende behov for at etablere pålidelige modeller, der kan give den manglende vaskulære signalering og struktur til hjerneorganoider, hvilket øger kompleksiteten af menneskelig hjerneorganoid generation7.
Blandt de foreslåede metoder til vaskularisering kan to hovedstrømlinjer overvejes: organoid indpodning i en levende organisme og rent in vitro teknologier co-kultivering af endotelceller og neurale celler 8,9,10,11,12. Intracerebral transplantation i mus er dyrt og tidskrævende, hvilket gør andre teknologier relevante for enklere modeller. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay er blevet brugt i vid udstrækning til at studere angiogenese 13,14,15. I det sidste årti har flere grupper med succes indpodet forskellige typer organoider, herunder nyre16,17, hjerte18 og tumororganoider19,20, i CAM’er. Ikke desto mindre er der lidt kendt om effektiviteten, toksicitet / afvisning, fysiologisk effekt og metoder til at indpode menneskelige hjerneorganoider i CAM. Et andet interessant og endnu uudforsket aspekt er dannelsen af en kimær blod-hjerne-barriere (BBB) mellem CAM og den organoide astrocytiske grænseflade. Tidligere banebrydende arbejde foreslog den formodede gennemførlighed af at generere en BBB i CAM ved at transplantere astrocytter og astrocytkonditioneret medium 21,22,23. Imidlertid synes modne astrocytter ikke at være i stand til at opnå disse24,25. Således forbliver den astrocyt-inducerede dannelse af BBB diskutabel, og transplantation af menneskelige hjerneorganoider ville give os mulighed for at kaste lys over denne kontrovers.
Denne videoartikel beskriver en protokol for en in ovo menneskelig hjerneorganoidtransplantation i CAM, der fremmer vækst, forbedring og vaskularisering, hvilket resulterer i organoider, der omfatter histologisk kompatible BBB-elementer. Her præsenterer vi en protokol, der sikrer kyllingembryoets overlevelse og rapporterer om CAM’s tilladelse til at opretholde hjernens organoidvækst.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse beskriver vi en detaljeret protokol med adskillige vigtige trin, der giver gunstig vækst og udvikling af menneskelige hjerneorganoider ved podning uden at forstyrre kyllingembryonernes overlevelse. Vi anbefalede brug af sterile nåle til at punktere æggets luftkammer efter 24 timers inkubation (dag 1). Derudover forsøgte vi også at punktere på dag 4 (efter at have kontrolleret æggeskallen med lys for at teste udviklingen af vaskulaturen for at være sikker på, at vi kun arbejdede med sunde em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Alcántara og Dr. Ortega fra UB og resten af medlemmerne i Dr. Acostas laboratorium for de indsigtsfulde diskussioner. S.A. er Serra-Hunter adjunkt fra Generalitat de Catalunya ved Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
