אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.
Abstract
השתלת אורגנואידים ברקמות כלי דם בחיות מודל, כגון עכבר מדוכא חיסון או קרום כוריואלנטואי של עובר אפרוח (CAM), הוכחה כיעילה עבור מודלים neovascularization. ה- CAM הוא קרום חוץ-עוברי עשיר בכלי הדם, אשר מראה תגובתיות חיסונית מוגבלת, ובכך הופך למודל אירוח מצוין להשתלות תאים ממקור אנושי.
מאמר זה מתאר את האסטרטגיה להשתלת אורגנואידים במוח האנושי המובחנים בשלבי הבשלה מרובים לתוך CAM. ההרכב התאי של אורגנואידים במוח משתנה עם הזמן, ומשקף את אבני הדרך של התפתחות המוח האנושי. השתלנו אורגנואידים במוח בשלבי הבשלה רלוונטיים: התרחבות נוירואפיתל (18 DIV), נוירוגנזה מוקדמת (60 DIV) וגליוגנזה מוקדמת (180 DIV) לתוך CAM של עוברי תרנגולות ביום העוברי (E)7. אורגנואידים מושתלים במוח נקטפו 5 ימים לאחר מכן ותכונותיהם ההיסטולוגיות נותחו.
לא התגלו סימנים היסטולוגיים של ניאו-וסקולריזציה באורגנואידים המושתלים או בכלי דם חריגים הסמוכים להשתלות. יתר על כן, שינויים מדהימים נצפו בהרכב התאי של האורגנואידים המושתלים, כלומר, עלייה במספר האסטרוציטים של חלבון גליה פיברילרי חומצי-חיובי-תגובתי. עם זאת, השינויים הציטוארכיטקטוניים היו תלויים בשלב ההבשלה האורגנואידי. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שאורגנואידים במוח יכולים לגדול ב- CAM, והם מראים הבדלים בציטוארכיטקטורה בהתאם לשלב ההבשלה שלהם בהשתלה.
Introduction
אורגנואידים של המוח האנושי הם טכניקה מתפתחת המאפשרת לנו לשחזר את ההתפתחות המוקדמת של המוח האנושי במבחנה 1,2,3. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של מודל זה היא חוסר כלי דם, אשר ממלא תפקידים חיוניים לא רק בהומאוסטזיס המוח אלא גם בהתפתחות המוח4. בנוסף לאספקת חמצן וחומרים מזינים, עדויות מצטברות מצביעות על כך שמערכת כלי הדם במוח מווסתת התמיינות עצבית, נדידה וסינפטוגנזה במהלך התפתחות 5,6. לכן, יש צורך דחוף להקים מודלים אמינים שיכולים לספק את האיתות והמבנה הווסקולרי החסר לאורגנואידים במוח, ולשפר את המורכבות של דור אורגנואיד המוח האנושי7.
בין השיטות המוצעות לכלי דם, ניתן לשקול שני ייעולים עיקריים: השתלת אורגנואידים לאורגניזם חי וטכנולוגיות חוץ גופיות גרידא בגידול משותף של תאי אנדותל ותאים עצביים 8,9,10,11,12. השתלה תוך-מוחית בעכברים היא יקרה וגוזלת זמן, מה שהופך טכנולוגיות אחרות לרלוונטיות עבור מודלים פשוטים יותר. בדיקת הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) שימשה באופן נרחב לחקר אנגיוגנזה 13,14,15. בעשור האחרון, מספר קבוצות הצליחו להשתיל סוגים שונים של אורגנואידים, כולל כליות16,17, לב18 ואורגנואידים סרטניים19,20, לתוך CAMs. עם זאת, מעט ידוע על היעילות, רעילות/דחייה, השפעה פיזיולוגית ושיטות להשתלת אורגנואידים במוח האנושי לתוך CAM. היבט מעניין נוסף שעדיין לא נחקר הוא היווצרות מחסום דם-מוח כימרי (BBB) בין ה-CAM לבין הממשק האסטרוציטי האורגנואידי. עבודה חלוצית קודמת הציעה את ההיתכנות המשוערת של יצירת BBB ב- CAM על ידי השתלת אסטרוציטים ותווך מותנה אסטרוציטים 21,22,23. עם זאת, נראה כי אסטרוציטים בוגרים אינם מסוגלים להשיג זאת24,25. לפיכך, היווצרות האסטרוציטים של BBB נותרה שנויה במחלוקת, והשתלת אורגנואידים במוח אנושי תאפשר לנו לשפוך אור על מחלוקת זו.
מאמר וידאו זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואיד מוח אנושי לתוך CAM המקדם צמיחה, שיפור וכלי דם, וכתוצאה מכך אורגנואידים הכוללים אלמנטים היסטולוגיים תואמים BBB. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבטיח את הישרדותו של עובר התרנגולת ומדווחים על המתירנות של CAM כדי לשמור על צמיחת אורגנואידים במוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עם שלבים מרכזיים רבים המספקים צמיחה והתפתחות חיובית של אורגנואידים במוח האנושי עם השתלתם מבלי להפריע להישרדותם של עוברי התרנגולות. המלצנו להשתמש במחטים סטריליות כדי לנקב את תא האוויר של הביצה לאחר 24 שעות של דגירה (יום 1). בנוסף, ניסינו גם לבצע את הניקור ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אלקנטרה ולד”ר אורטגה מ-UB ולשאר החברים במעבדה של ד”ר אקוסטה על הדיונים מלאי התובנה. S.A. הוא סרה-האנטר עמית עוזר פרופסור מ Generalitat de Catalunya באוניברסיטת ברצלונה.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
