Summary

Раннее неуправляемое моделирование органоидной нейроваскулярной ниши головного мозга человека в пермиссивной хориоаллантоической мембране эмбриона цыпленка

Published: February 16, 2024
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол по приживлению органоидов головного мозга человека на нескольких стадиях созревания в хориоаллантоисную мембрану (CAM) цыплят. Органоиды головного мозга выращивались в соответствии с неуправляемыми стандартизированными протоколами.

Abstract

Приживление органоидов в васкуляризированные ткани модельных животных, таких как хориоаллантоическая мембрана (CAM) эмбрионов мышей или цыплят с иммунодефицитом, доказало свою эффективность для моделирования неоваскуляризации. CAM представляет собой богато васкуляризированную экстраэмбриональную мембрану, которая демонстрирует ограниченную иммунореактивность, что делает ее отличной моделью для трансплантации клеток человеческого происхождения.

В данной работе описывается стратегия приживления органоидов головного мозга человека, дифференцированных на нескольких стадиях созревания, в CAM. Клеточный состав органоидов головного мозга меняется со временем, отражая вехи развития мозга человека. Мы трансплантировали органоиды головного мозга на соответствующих стадиях созревания: нейроэпителиальная экспансия (18 DIV), ранний нейрогенез (60 DIV) и ранний глиогенез (180 DIV) в КАМ эмбриональных (E)7 куриных эмбрионов. Через 5 дней забирали приживленные органоиды головного мозга и анализировали их гистологические особенности.

Гистологических признаков неоваскуляризации в трансплантированных органоидах или аномальных кровеносных сосудах, прилегающих к трансплантатам, не выявлено. Более того, наблюдались заметные изменения в клеточном составе трансплантированных органоидов, а именно увеличение количества глиальных фибриллярных кислых белково-позитивно-реактивных астроцитов. Однако цитоархитектурные изменения зависели от стадии органоидного созревания. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что органоиды мозга могут расти в CAM, и они показывают различия в цитоархитектонике в зависимости от стадии их созревания при трансплантации.

Introduction

Органоиды человеческого мозга – это новый метод, который позволяет нам повторить раннее развитие человеческого мозга in vitro 1,2,3. Тем не менее, одним из основных ограничений этой модели является отсутствие васкуляризации, которая играет незаменимую роль не только в гомеостазе мозга, но ив развитии мозга. В дополнение к доставке кислорода и питательных веществ, накопленные данные свидетельствуют о том, что сосудистая система мозга регулирует дифференцировку нейронов, миграцию и синаптогенез во время развития 5,6. Таким образом, существует острая необходимость в создании надежных моделей, которые могут обеспечить недостающую сосудистую сигнализацию и структуру органоидов головного мозга, повышая сложность органоидов мозга человека7-го поколения.

Среди предложенных методов васкуляризации можно рассмотреть два основных направления: приживление органоидов в живой организм и чисто in vitro технологии совместного культивирования эндотелиальных и нервных клеток 8,9,10,11,12. Внутримозговая трансплантация у мышей является дорогостоящей и трудоемкой процедурой, что делает другие технологии актуальными для более простых моделей. Анализ хориоаллантоической мембраны цыплят (CAM) широко использовался для изучения ангиогенеза 13,14,15. За последнее десятилетие несколько групп успешно внедрили различные типы органоидов, включая почку16,17, сердечную18 и опухолевую органоиды19,20, в КАМ. Тем не менее, мало что известно об эффективности, токсичности/отторжении, физиологическом эффекте и методах приживления органоидов человеческого мозга в CAM. Другим интересным и пока неизученным аспектом является формирование химерного гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) между КАМ и органоидным астроцитарным интерфейсом. Предыдущая новаторская работа предполагала предполагаемую возможность получения ГЭБ в CAM путем трансплантации астроцитов и астроцит-кондиционированной среды 21,22,23. Однако зрелые астроциты, по-видимому, не в состоянии достичь этогопоказателя 24,25. Таким образом, индуцированное астроцитами образование ГЭБ остается спорным, и трансплантация органоидов человеческого мозга позволила бы нам пролить свет на это противоречие.

В этой видеостатье описывается протокол трансплантации органоидов головного мозга человека in ovo в CAM, который способствует росту, улучшению и васкуляризации, в результате чего образуются органоиды, включающие гистологически совместимые элементы ГЭБ. Здесь мы представляем протокол, обеспечивающий выживание куриного эмбриона, и сообщаем о допустимости CAM для поддержания роста органоидов мозга.

Protocol

Эмбрионы курицы белого леггорна (Gallus gallus) обрабатывались в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Института ресурсов лабораторных животных, Комиссии наук о жизни, Национального исследовательского совета, США, и эксперименты были одобрены Сове…

Representative Results

Выбор графика созревания эмбриона для трансплантацииЭксперимент начинается при D0, когда оплодотворенные яйца инкубируются при температуре 38 °C и относительной влажности воздуха 60%. Хориоаллантоисная мембрана (CAM) представляет собой высоковаскуляризированную внеэмбрионал…

Discussion

В данном исследовании мы описываем подробный протокол с многочисленными ключевыми этапами, которые обеспечивают благоприятный рост и развитие органоидов головного мозга человека при трансплантации, не нарушая выживаемость куриных эмбрионов. Мы рекомендовали использовать стерильны…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Алькантару и д-ра Ортегу из UB, а также остальных сотрудников лаборатории д-ра Акосты за содержательные обсуждения. С.А. является доцентом Женералитата Каталонии в Университете Барселоны.

Materials

Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse  BioLegend 801201 1:1,000
Anti-GFAP, rabbit GeneTex GTX108711 1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. Invitrogen A-21206 1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat Jackson ImmunoResearch 715-585-150 1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI Invitrogen D1306 1:10,000
DPX Sigma 100579 xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation Solution CreativeBiolabs ITS-0622-YT187 cell dissociation solution
Matrigel BD Biosciences 356234
Mowiol 4-88 mounting media Merk 81381
Paper towel, lab-grade Sigma-Aldrich Z188956
ROCK inhibitor Y27632 Millipore SCM075 10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors VWR 470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ

References

  1. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
  4. Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
  5. Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
  6. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  7. Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
  8. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  9. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  10. Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
  11. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  12. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
  13. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
  14. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  15. Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
  16. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
  17. Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
  18. Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
  19. Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
  20. Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
  21. Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
  22. Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
  23. Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
  24. Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
  25. Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
  26. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
  27. Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
  28. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  29. Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
  30. Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
  31. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
  32. Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
  33. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).

Play Video

Cite This Article
Fiore, L., Arderiu, J., Martí-Sarrias, A., Turpín, I., Pareja, R. I., Navarro, A., Holubiec, M., Bianchelli, J., Falzone, T., Spelzini, G., Scicolone, G., Acosta, S. Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (204), e65710, doi:10.3791/65710 (2024).

View Video