प्रारंभिक अनगाइडेड मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड न्यूरोवास्कुलर आला मॉडलिंग अनुमेय चिक भ्रूण Chorioallantoic झिल्ली में मॉडलिंग
Summary
यहां, हम मानव मस्तिष्क के अंगों को कई परिपक्वता चरणों में चिक कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) में संलग्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मस्तिष्क के ऑर्गेनोइड को अनियंत्रित मानकीकृत प्रोटोकॉल के बाद उगाया गया था।
Abstract
मॉडल जानवरों में संवहनी ऊतकों में ऑर्गेनोइड को उकेरना, जैसे कि इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस या चिक भ्रूण कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम), नवसंवहनीकरण मॉडलिंग के लिए कुशल साबित हुआ है। सीएएम एक समृद्ध संवहनी extraembryonic झिल्ली है, जो सीमित immunoreactivity से पता चलता है, इस प्रकार मानव मूल सेल प्रत्यारोपण के लिए एक उत्कृष्ट होस्टिंग मॉडल बन गया है.
यह पत्र सीएएम में कई परिपक्वता चरणों में विभेदित मानव मस्तिष्क के अंगों को उकेरने की रणनीति का वर्णन करता है। मस्तिष्क के अंगों की सेलुलर संरचना समय के साथ बदलती है, जो मानव मस्तिष्क के विकास के मील के पत्थर को दर्शाती है। हमने प्रासंगिक परिपक्वता चरणों में मस्तिष्क के अंगों को ग्राफ्ट किया: भ्रूण दिवस (ई) 7 चिकन भ्रूण के सीएएम में न्यूरोपीथेलियल विस्तार (18 डीआईवी), प्रारंभिक न्यूरोजेनेसिस (60 डीआईवी), और प्रारंभिक ग्लियोजेनेसिस (180 डीआईवी)। उत्कीर्ण मस्तिष्क ऑर्गेनोइड को 5 दिन बाद काटा गया और उनकी ऊतकीय विशेषताओं का विश्लेषण किया गया।
ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड या ग्राफ्टिंग से सटे असामान्य रक्त वाहिकाओं में नवसंवहनीकरण के कोई हिस्टोलॉजिकल संकेत नहीं पाए गए। इसके अलावा, ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड की सेलुलर संरचना में उल्लेखनीय परिवर्तन देखे गए, अर्थात्, ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन-पॉजिटिव-रिएक्टिव एस्ट्रोसाइट्स की संख्या में वृद्धि। हालांकि, साइटोआर्किटेक्चरल परिवर्तन ऑर्गेनॉइड परिपक्वता चरण पर निर्भर थे। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि मस्तिष्क के अंग सीएएम में बढ़ सकते हैं, और वे ग्राफ्टिंग में उनकी परिपक्वता अवस्था के आधार पर साइटोआर्किटेक्चर में अंतर दिखाते हैं।
Introduction
मानव मस्तिष्क organoids एक उभरती हुई तकनीक है कि हमें इन विट्रो 1,2,3 में मानव मस्तिष्क के प्रारंभिक विकास पुनरावृत्ति करने के लिए अनुमति देता है. फिर भी, इस मॉडल की प्रमुख सीमाओं में से एक संवहनी की कमी है, जो न केवल मस्तिष्क होमियोस्टेसिस में बल्कि मस्तिष्क के विकास में भी अपरिहार्य भूमिका निभाताहै। ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के अलावा, सबूत जमा करने से पता चलता है कि मस्तिष्क की संवहनी प्रणाली 5,6 के विकास के दौरान तंत्रिका भेदभाव, प्रवासन और सिनैप्टोजेनेसिस को नियंत्रित करती है। इसलिए, विश्वसनीय मॉडल स्थापित करने की तत्काल आवश्यकता है जो मस्तिष्क के अंगों को लापता संवहनी संकेत और संरचना प्रदान कर सकते हैं, जिससे मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पीढ़ी7 की जटिलता बढ़ जाती है।
संवहनी के लिए प्रस्तावित तरीकों के बीच, दो मुख्य streamlines पर विचार किया जा सकता है: organoid एक जीवित जीव में engrafting और विशुद्ध रूप से इन विट्रो प्रौद्योगिकियों सह संवर्धन endothelial कोशिकाओं और तंत्रिका कोशिकाओं 8,9,10,11,12. चूहों में इंट्रासेरेब्रल प्रत्यारोपण महंगा और समय लेने वाला है, जिससे अन्य प्रौद्योगिकियां सरल मॉडल के लिए प्रासंगिक हो जाती हैं। चिक कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) परख का उपयोग एंजियोजेनेसिस 13,14,15का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। पिछले दशक में, कई समूहों सफलतापूर्वक सीएएम में गुर्दे16,17, हृदय18, और ट्यूमर organoids19,20 सहित organoids के विभिन्न प्रकार उत्कीर्ण किया है. फिर भी, प्रभावकारिता, विषाक्तता / अस्वीकृति, शारीरिक प्रभाव और सीएएम में मानव मस्तिष्क के अंगों को उकेरने के तरीकों के बारे में बहुत कम जानकारी है। एक और दिलचस्प और अभी तक बेरोज़गार पहलू सीएएम और ऑर्गेनॉइड एस्ट्रोसाइटिक इंटरफ़ेस के बीच एक काइमेरिक रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) का गठन है। पिछले अग्रणी काम astrocytes और astrocyte-वातानुकूलित माध्यम 21,22,23प्रत्यारोपण द्वारा सीएएम में एक बीबीबी उत्पन्न करने की ख्यात व्यवहार्यता का सुझाव दिया. हालांकि, परिपक्व एस्ट्रोसाइट्स इस24,25 को प्राप्त करने में असमर्थ प्रतीत होते हैं। इस प्रकार, बीबीबी का एस्ट्रोसाइट-प्रेरित गठन बहस योग्य बना हुआ है, और मानव मस्तिष्क के अंगों को प्रत्यारोपित करने से हमें इस विवाद पर प्रकाश डालने की अनुमति मिलेगी।
यह वीडियो लेख सीएएम में ओवो मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो विकास, सुधार और संवहनी को बढ़ावा देता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड होते हैं जो हिस्टोलॉजिकल रूप से संगत बीबीबी तत्वों को शामिल करते हैं। यहां, हम चिकन भ्रूण के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और मस्तिष्क के अंग विकास को बनाए रखने के लिए सीएएम की अनुमति पर रिपोर्ट करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम कई महत्वपूर्ण चरणों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो चिकन भ्रूण के अस्तित्व को परेशान किए बिना ग्राफ्टिंग पर मानव मस्तिष्क के अंगों के अनुकूल विकास और विकास प्रदान कर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम व्यावहारिक चर्चाओं के लिए यूबी से डॉ. अलकांतारा और डॉ. ओर्टेगा और डॉ. अकोस्टा की प्रयोगशाला के बाकी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। एसए सेरा-हंटर यूनिवर्सिटैट डी बार्सिलोना में जनरलिटेट डी कैटालुन्या के साथी सहायक प्रोफेसर हैं।
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
