寛容なニワトリ胚絨毛膜への初期の非誘導ヒト脳オルガノイド神経血管ニッチモデリング
Summary
ここでは、複数の成熟段階にあるヒト脳オルガノイドをニワトリの絨毛膜膜(CAM)に生着させるプロトコルを紹介します。脳オルガノイドは、ガイドなしで標準化されたプロトコルに従って増殖しました。
Abstract
免疫不全マウスやニワトリ胚の絨毛膜膜(CAM)などのモデル動物の血管新生組織にオルガノイドを生着させることは、血管新生モデリングに有効であることが証明されています。CAMは血管新生した胚外膜であり、免疫反応性が限られているため、ヒト由来の細胞移植の優れた宿主モデルとなっています。
本稿では、複数の成熟段階で分化したヒト脳オルガノイドをCAMに生着させる戦略について述べる。脳オルガノイドの細胞組成は、ヒトの脳発達のマイルストーンを反映して、時間とともに変化します。神経上皮拡大(18 DIV)、初期神経新生(60 DIV)、および初期神経膠形成(180 DIV)の関連する成熟段階の脳オルガノイドを、胚日(E)7ニワトリ胚のCAMに移植しました。生着した脳オルガノイドを5日後に採取し、その組織学的特徴を分析した。
移植されたオルガノイドまたは移植片に隣接する異常な血管における血管新生の組織学的兆候は検出されませんでした。.さらに、移植されたオルガノイドの細胞組成に顕著な変化、すなわちグリア線維性酸性タンパク質陽性反応性アストロサイトの数の増加が観察されました。しかし、細胞構造の変化はオルガノイドの成熟段階に依存していました。これらの結果は、脳オルガノイドがCAM内で増殖できることを示唆しており、移植時の成熟段階に応じて細胞構造に違いがあることを示しています。
Introduction
ヒト脳オルガノイドは、ヒト脳の初期発生をin vitroで再現することを可能にする新しい技術です1,2,3。しかし、このモデルの大きな限界の1つは、脳の恒常性だけでなく、脳の発達にも不可欠な役割を果たす血管新生の欠如です4。酸素と栄養素の供給に加えて、脳の血管系が発達中の神経分化、移動、シナプス形成を調節していることを示唆する証拠が蓄積されています5,6。したがって、欠落している血管シグナル伝達と構造を脳オルガノイドに提供し、ヒト脳オルガノイド第7世代の複雑さを高めることができる信頼性の高いモデルを確立することが急務です。
血管新生のために提案された方法の中で、2つの主要な合理化ラインを考慮することができます:生体へのオルガノイド生着と、内皮細胞と神経細胞を共培養する純粋なin vitro技術8,9,10,11,12。マウスの脳内移植はコストと時間がかかるため、より単純なモデルに関連する他の技術があります。ニワトリ絨毛膜(CAM)アッセイは、血管新生の研究に広く使用されています13,14,15。過去10年間で、いくつかのグループが、腎臓16,17、心臓18、腫瘍オルガノイド19,20など、さまざまなタイプのオルガノイドをCAMに生着させることに成功しました。それにもかかわらず、ヒト脳オルガノイドをCAMに生着させる有効性、毒性/拒絶反応、生理学的効果、および方法についてはほとんど知られていません。また、CAMとオルガノイド星状細胞界面の間にキメラ血液脳関門(BBB)が形成されるという、興味深い点もあります。以前の先駆的な研究は、アストロサイトとアストロサイトコンディショニング培地を移植することにより、CAMでBBBを生成することの推定上の実現可能性を示唆しました21,22,23。しかし、成熟したアストロサイトはこれを達成できないようです24,25。したがって、アストロサイトによるBBBの形成については議論の余地があり、ヒト脳オルガノイドを移植することで、この論争に光を当てることができます。
このビデオ記事では、成長、改善、血管新生を促進し、組織学的に適合するBBB要素を含むオルガノイドをもたらすCAMへの卵 子ヒト 脳オルガノイド移植のプロトコルについて説明します。ここでは、ニワトリ胚の生存を保証するプロトコルを提示し、脳オルガノイドの成長を維持するためのCAMの許容性について報告します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、ニワトリ胚の生存を乱すことなく、移植時にヒト脳オルガノイドの良好な成長と発達を提供する多数の重要なステップを含む詳細なプロトコルについて説明します。24時間の孵化後(1日目)に卵の空気室に穴を開けるために滅菌針の使用を推奨しました。さらに、4日目に穿刺を試みました(卵の殻を光でチェックして血管系の発達をテストし、健康な胚のみで作業していることを…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UBのAlcántara博士とOrtega博士、そしてAcosta博士の研究室の他のメンバーには、洞察に満ちた議論をしてくれたことに感謝します。S.A.は、バルセロナ大学カタルーニャ総合研究所のセラ・ハンター・フェロー助教授です。
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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