Clasificación unicelular de células madre mesenquimales inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos

Summary

Este protocolo describe el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia de células madre mesenquimales humanas utilizando el método de clasificación de una sola célula. Específicamente, el uso de la clasificación de una sola célula puede lograr una pureza del 99% de las células inmunofenotipadas de una población heterogénea cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSC) de un organismo poseen una extraordinaria capacidad para diferenciarse en múltiples linajes de células adultas en el cuerpo y son conocidas por sus propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias. El uso de estas células madre es una bendición para el campo de la biología regenerativa, pero al mismo tiempo, una pesadilla para la medicina regenerativa y la terapéutica debido a las múltiples ambigüedades celulares asociadas con ellas. Estas ambigüedades pueden surgir de la diversidad en la fuente de estas células madre y de sus condiciones de crecimiento in vitro , las cuales reflejan su heterogeneidad funcional.

Esto justifica metodologías para proporcionar poblaciones purificadas y homogéneas de MSC para aplicaciones terapéuticas. Los avances en el campo de la citometría de flujo han permitido la detección de poblaciones unicelulares mediante un enfoque multiparamétrico. Este protocolo describe una forma de identificar y purificar las células madre de los dientes deciduos exfoliados humanos (SHED) a través de la clasificación de células individuales asistida por fluorescencia. La expresión simultánea de marcadores de superficie, a saber, el isotiocianato de fluoresceína CD90 (FITC), la proteína CD73-peridinina-clorofila (PerCP-Cy5.5), la aloficocianina CD105 (APC) y la CD44-V450, identificó los expresores positivos “brillantes” de las MSC mediante citometría de flujo multiparamétrica. Sin embargo, se observó una disminución significativa en los porcentajes de expresores cuádruples de estos marcadores positivos desde el pasaje 7 en adelante hasta los pasajes posteriores.

Las subpoblaciones inmunofenotipadas se clasificaron utilizando el modo de clasificación de una sola célula, donde solo dos marcadores positivos y uno negativo constituyeron los criterios de inclusión. Esta metodología garantizó la viabilidad celular de las poblaciones clasificadas y mantuvo la proliferación celular después de la clasificación. La aplicación posterior para dicha clasificación se puede utilizar para evaluar la diferenciación específica del linaje para las subpoblaciones cerradas. Este enfoque se puede aplicar a otros sistemas de una sola célula para mejorar las condiciones de aislamiento y para adquirir información de marcadores de superficie celular múltiple.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSC) pueden considerarse como una fuente escalable de células adecuadas para terapias basadas en células y pueden considerarse un sistema de referencia en medicina regenerativa. Estas células se pueden aislar de una variedad de fuentes en el cuerpo con diferentes orígenes tisulares¹. Dependiendo de su tejido de origen, cada tipo de MSC muestra un comportamiento in vitro ambiguo². Esto se observa bien en sus propiedades morfológicas y funcionales³. Múltiples estudios han demostrado variación intraclonal en las dimensiones, incluyendo la diferenciación tisular adulta, el estado genómico y la arquitectura metabólica y celular de las MSCs ^2,4.

El inmunofenotipado de células ha sido una aplicación común de la citometría de flujo para la identificación de células madre y esto fue utilizado por la Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) en 2006 para prescribir una lista de criterios mínimos para identificar células como MSC. Afirmó que junto con la adherencia plástica y la capacidad de diferenciarse en tres linajes (osteogénico, condrogénico y adipogénico) in vitro, ≥95% de la población celular debe expresar CD105, CD73, CD90, y estas células deben carecer de la expresión (≤2% positiva) de CD34, CD45, CD11b, CD14 y HLA-DR, medida por citometría de flujo⁵. A pesar de que las MSC se definieron mediante un conjunto de biomarcadores bajo los criterios mínimos de la ISCT, sus propiedades inmunes no pudieron compararse con estos biomarcadores y se necesitaba más allá de estos criterios para facilitar la cuantificación de las comparaciones entre estudios y las variaciones clonales².

A pesar de las directrices marcadas por el ISCT, una amplia investigación sobre las MSC ha demostrado que existe heterogeneidad en esta población, lo que podría deberse a una multitud de factores, principalmente debido a la naturaleza ubicua de la heterogeneidad que surge entre los donantes de MSC⁶, las fuentes de tejidos⁷, las células individuales dentro de una población clonal⁸ y las condiciones de cultivo ^{2,9. 10}. La caracterización y purificación de estas células primarias a partir de una variedad de fuentes de tejidos para garantizar la calidad y el destino celular son pasos clave en su producción. La necesidad de comprender las variaciones mostradas entre la población requiere un método eficiente para resolverlas en subpoblaciones que puedan dividirse y recogerse por separado¹¹. Los análisis a nivel de una sola célula ayudan a superar los desafíos de la variación célula-célula, reducen el ruido biológico que surge de una población heterogénea y ofrecen la capacidad de investigar y caracterizar células raras¹².

En función del propósito y los parámetros elegidos, se pueden emplear varios métodos para clasificar y enriquecer las poblaciones seleccionadas. Las técnicas de clasificación por células pueden comprender tanto la clasificación masiva como los métodos de clasificación por células. Mientras que la clasificación masiva puede enriquecer las poblaciones objetivo a través de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)13, el fraccionamiento¹⁴ y la elutriación 15, la clasificación de células individuales puede enriquecer poblaciones más homogéneas mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)¹¹. En la Tabla 1 se destaca un análisis comparativo de cada uno de estos métodos con su propio conjunto de ventajas y desventajas.

Tabla 1: Análisis comparativos de diferentes técnicas: MACS, Fraccionamiento, Elutriación y FACS destacando las diferencias en su principio y las ventajas y desventajas de elegir una técnica en particular sobre otra. Abreviaturas: MACS = Clasificación celular activada magnéticamente; FACS = Clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Desde el advenimiento de la técnica, la citometría de flujo de una sola célula ha desempeñado un papel importante en la enumeración¹⁶, detección y caracterización de una población celular específica en una muestra heterogénea¹⁷. Hewitt et al. en 2006 sentaron las bases de la metodología de clasificación celular automatizada para mejorar el aislamiento de grupos homogéneos de células madre embrionarias humanas diferenciadas (hESCs)¹⁸. La clasificación unicelular enriqueció la población de células madre embrionarias transducidas por GFP, facilitando el aislamiento de clones modificados genéticamente, lo que abrió una nueva dimensión en la investigación clínica. Para mejorar la eficiencia de la clasificación, generalmente se han adoptado dos enfoques; O bien se modifican los medios de recolección de las poblaciones clasificadas para mantener la viabilidad y proliferación de las células posclasificadas¹⁹ o bien se modifica adecuadamente el algoritmo/software de clasificación celular¹².

Con el avance de la tecnología, los citómetros de flujo comerciales y los clasificadores celulares han podido ayudar a abordar los desafíos que se enfrentaron al clasificar asépticamente poblaciones celulares frágiles y raras, especialmente células madre de diferentes orígenes. Uno de los principales desafíos de los biólogos de células madre ha sido el aislamiento clonal de células madre pluripotentes humanas siguiendo los protocolos de transfección requeridos en los estudios de edición génica¹⁹. Esto se abordó mediante la clasificación de células individuales en placas de 96 pocillos que se recubrieron con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) junto con suplementos e inhibidores comerciales de ROCK de moléculas pequeñas. Sin embargo, las estrategias de aislamiento celular podrían refinarse en gran medida con el uso de la clasificación por índices, una característica del algoritmo de clasificación que identifica el inmunofenotipo de las células individuales clasificadas¹². Esta modalidad refinada en la clasificación de células individuales ayudó no solo a mejorar la eficiencia de clasificación de las células madre, especialmente en lo que respecta a las poblaciones de células madre hematopoyéticas raras, sino que también vinculó de manera eficiente los clones de células individuales a sus ensayos funcionales posteriores²⁰.

Este artículo se centra en la clasificación unicelular de células madre inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos (SHEDs) para el enriquecimiento de subpoblaciones con el fin de estudiar sus capacidades de diferenciación funcional. Utilizando una combinación de dos marcadores MSC positivos, CD90 y CD73, y un marcador hematopoyético negativo CD45, se inmunofenotiparon las MSC y se identificaron los expresores dim y null. Con base en su inmunofenotipo, las subpoblaciones se identificaron como MSC puras, poblaciones positivas simples y poblaciones negativas dobles. Se clasificaron utilizando el modo de clasificación de una sola célula para obtener subpoblaciones puras y enriquecidas para estudios funcionales posteriores con el fin de identificar si la expresión diferencial de los marcadores era un artefacto de las condiciones de cultivo in vitro o si también tiene algún efecto sobre las propiedades funcionales. Las células que no eran expresoras homogéneas de los “marcadores MSC positivos” se clasificaron para estudiar sus propiedades funcionales.

Protocol

Aprobación ética y consentimiento para participar: Se recibieron muestras de pulpa dental caducifolia exfoliada humana después de obtener el consentimiento informado y la aprobación ética completa por parte del Departamento Oral y Maxilofacial del Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bangalore, de acuerdo con los estándares establecidos por el Comité de Autorización Ética Hospitalaria, SRGCDS. Después de lo cual el aislamiento, el cultivo, el mantenimiento y la aplicación de SHEDs fueron apro…

Representative Results

Los SHEDs se caracterizaron con ensayos de inmunofluorescencia estándar que mostraron la expresión de vimentina (rojo, filamentos intermedios tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) y núcleos teñidos con DAPI (Figura 1A). Para estimar sus capacidades proliferativas y formadoras de colonias, se realizaron ensayos estándar de crecimiento celular a corto plazo. En la Figura 1B se muestra un aumento de 14,3 veces en la tasa de prolif…

Discussion

En el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, entre las fuentes postnatales, las MSC derivadas de tejidos orales han atraído un profundo interés debido a sus obligaciones éticas mínimas y a su notable potencial de diferenciación multilinaje²¹. Las células madre de la pulpa dental (CPD) del tercer molar impactado y las SHEDs han atraído la mayor atención entre las MSC dentales por su potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y traumáticas<sup class="x…

Materials

Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	—
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	—
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	—	—	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	—-	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin – EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5