İnsan Eksfoliye Edilmiş Yaprak Döken Dişlerden İmmünfenotipli Mezenkimal Kök Hücrelerin Tek Hücreli Sınıflandırılması
Summary
Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.
Abstract
Bir organizmanın mezenkimal kök hücreleri (MSC’ler), vücuttaki birden fazla yetişkin hücre soyuna farklılaşmak için olağanüstü bir kapasiteye sahiptir ve immünomodülatör ve antienflamatuar özellikleri ile bilinir. Bu kök hücrelerin kullanımı, rejeneratif biyoloji alanı için bir nimettir, ancak aynı zamanda, bunlarla ilişkili çoklu hücresel belirsizlikler nedeniyle rejeneratif tıp ve terapötikler için bir felakettir. Bu belirsizlikler, bu kök hücrelerin kaynağındaki çeşitlilikten ve her ikisi de fonksiyonel heterojenliklerini yansıtan in vitro büyüme koşullarından kaynaklanabilir.
Bu, terapötik uygulamalar için saflaştırılmış, homojen MSC popülasyonları sağlamak için metodolojileri garanti eder. Akış sitometrisi alanındaki gelişmeler, multiparametrik bir yaklaşım kullanılarak tek hücreli popülasyonların saptanmasını sağlamıştır. Bu protokol, floresan destekli tek hücreli sıralama yoluyla insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED’ler) kök hücreleri tanımlamanın ve saflaştırmanın bir yolunu ana hatlarıyla belirtir. CD90-floresein izotiyosiyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofil proteini (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikosiyanin (APC) ve CD44-V450 gibi yüzey belirteçlerinin eşzamanlı ekspresyonu, multiparametrik akış sitometrisi kullanarak MSC’lerin “parlak”, pozitif ekspresörlerini tanımladı. Bununla birlikte, bu pozitif belirteçlerin dörtlü ekspresyonörlerinin yüzdelerinde 7. pasajdan sonraki pasajlara kadar önemli bir düşüş gözlendi.
İmmünfenotipli alt popülasyonlar, sadece iki pozitif ve bir negatif markörün dahil etme kriterlerini oluşturduğu tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandı. Bu metodoloji, tasnif edilen popülasyonların hücre canlılığını sağladı ve tasnif sonrası hücre proliferasyonunu sürdürdü. Bu tür bir sıralama için aşağı akış uygulaması, kapılı alt popülasyonlar için soya özgü farklılaşmayı değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izolasyon koşullarını iyileştirmek ve çoklu hücre yüzeyi işaretleyici bilgisi elde etmek için diğer tek hücreli sistemlere uygulanabilir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), hücre bazlı tedaviler için uygun, ölçeklenebilir bir hücre kaynağı olarak kabul edilebilir ve rejeneratif tıpta altın standart bir sistem olarak kabul edilebilir. Bu hücreler, vücutta farklı doku kökenlerine sahip çeşitli kaynaklardan izole edilebilir1. Kaynak dokularına bağlı olarak, her MSC tipi belirsiz bir in vitro davranış sergiler2. Bu, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinde iyi gözlenir3. Çok sayıda çalışma, yetişkin doku farklılaşması, genomik durum ve MSC’lerin metabolik ve hücresel mimarisi dahil olmak üzere boyutlarda klonal varyasyon göstermiştir 2,4.
Hücrelerin immünofenotiplemesi, kök hücrelerin tanımlanması için akış sitometrisinin yaygın bir uygulaması olmuştur ve bu, 2006 yılında Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT) tarafından hücreleri MSC’ler olarak tanımlamak için minimal kriterlerin bir listesini reçete etmek için kullanılmıştır. Plastik yapışma ve in vitro olarak üç soya (osteojenik, kondrojenik ve adipojenik) farklılaşma yeteneği ile birlikte, hücre popülasyonunun %≥95’inin CD105, CD73, CD90 eksprese etmesi gerektiğini ve bu hücrelerin akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi CD34, CD45, CD11b, CD14 ve HLA-DR ekspresyonundan (%≤2 pozitif) yoksun olması gerektiğini belirtmiştir5. MSC’ler, ISCT’nin minimal kriterleri altında bir dizi biyobelirteç tarafından tanımlanmış olsa da, bağışıklık özellikleri bu biyobelirteçlerle kıyaslanamamıştır ve çapraz çalışma karşılaştırmalarını ve klonal varyasyonları ölçmeyi kolaylaştırmak için bu kriterlerin ötesinde daha fazlasına ihtiyaç vardır2.
ISCT tarafından belirlenen yönergelere rağmen, MSC’ler üzerine yapılan kapsamlı araştırmalar, bu popülasyonda, esas olarak MSC donörleri6, doku kaynakları7, klonal popülasyon8 içindeki bireysel hücreler ve kültür koşulları 2,9 arasında ortaya çıkan heterojenliğin her yerde bulunan doğası nedeniyle ortaya çıkabilecek çok sayıda faktöre bağlı olarak ortaya çıkabilecek heterojenliğin var olduğunu göstermiştir. 10. Kaliteyi ve hücre kaderini sağlamak için bu birincil hücrelerin çeşitli doku kaynaklarından karakterizasyonu ve saflaştırılması, üretimlerinde kilit adımlardır. Popülasyon arasında sergilenen varyasyonları anlama ihtiyacı, onu ayrı ayrı bölünebilen ve toplanabilen alt popülasyonlara çözmek için etkili bir yöntem gerektirir11. Tek hücre düzeyinde analizler, hücre-hücre varyasyonunun zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olur, heterojen bir popülasyondan kaynaklanan biyolojik gürültüyü azaltır ve nadir hücreleri araştırma ve karakterize etme yeteneği sunar12.
Amaca ve seçilen parametrelere bağlı olarak, seçilen popülasyonları sıralamak ve zenginleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Hücre sıralama teknikleri, hem toplu sıralama hem de tek hücreli sıralama yöntemlerini içerebilir. Toplu sıralama, Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması (MACS)13, fraksiyonlama 14 ve elütriasyon15 yoluyla hedef popülasyonları zenginleştirebilirken, tek hücreli sıralama, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS)11 yoluyla daha homojen popülasyonları zenginleştirebilir. Bu yöntemlerin her birinin kendi avantaj ve dezavantajları ile karşılaştırmalı bir analizi Tablo 1’de vurgulanmıştır.
Tablo 1: Farklı tekniklerin karşılaştırmalı analizleri: MACS, Fraksiyonlama, Elütriasyon ve FACS, prensiplerindeki farklılıkları ve belirli bir tekniği diğerine göre seçmenin avantaj ve dezavantajlarını vurgulamaktadır. Kısaltmalar: MACS = Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması; FACS = Floresanla aktive edilen hücre sıralaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tekniğin ortaya çıkışından bu yana, tek hücreli akış sitometrisi, heterojen bir örnekte17 belirli bir hücre popülasyonunun sayımında16, tespitinde ve karakterizasyonunda önemli bir rol oynamıştır. Hewitt ve ark. 2006 yılında, farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC’ler) homojen havuzlarının izolasyonunu geliştirmek için otomatik hücre sıralama metodolojisinin temelini attı18. Tek hücreli ayıklama, genetik olarak değiştirilmiş klonların izolasyonunu kolaylaştırarak GFP ile dönüştürülmüş hESC’lerin popülasyonunu zenginleştirdi ve bu da klinik araştırmalarda yeni bir boyut açtı. Sıralama verimliliğini artırmak için genellikle iki yaklaşım benimsenmiştir; Ya sıralanmış popülasyonların toplama ortamı, sıralanmış hücrelerin19 canlılığını ve çoğalmasını sürdürmek için değiştirilir ya da hücre sıralama algoritması/yazılımı uygun şekilde değiştirilir12.
Teknolojinin ilerlemesiyle, ticari akış sitometreleri ve hücre ayıklayıcıları, kırılgan ve nadir hücre popülasyonlarını, özellikle de farklı kökenlerden kök hücreleri aseptik olarak ayırırken karşılaşılan zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olmuştur. Kök hücre biyologlarının en büyük zorluklarından biri, gen düzenleme çalışmalarında gerekli olan transfeksiyon protokollerini takiben insan pluripotent kök hücrelerinin klonal izolasyonu olmuştur19. Bu, tek hücrelerin, takviyeler ve ticari küçük moleküllü ROCK inhibitörleri ile birlikte Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF’ler) ile kaplanmış 96 oyuklu plakalara ayrılmasıyla ele alındı. Bununla birlikte, hücre izolasyon stratejileri, sıralanan tek tek hücrelerin immünofenotipini tanımlayan sıralama algoritmasının bir özelliği olan indeks sıralaması kullanılarak büyük ölçüde rafine edilebilir12. Tek hücreli ayıklamadaki bu rafine modalite, özellikle nadir hematopoietik kök hücre popülasyonları ile ilgili olarak, yalnızca kök hücreler için sıralama verimliliğini arttırmaya yardımcı olmakla kalmadı, aynı zamanda tek hücreli klonları aşağı akış fonksiyonel tahlillerine verimli bir şekilde bağladı20.
Bu makale, fonksiyonel farklılaşma kapasitelerini incelemek için alt popülasyonların zenginleştirilmesi için insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED’ler) immünofenotipli kök hücrelerin tek hücreli olarak sınıflandırılmasına odaklanmaktadır. İki MSC-pozitif belirteç, CD90 ve CD73 ve negatif hematopoietik belirteç CD45’in bir kombinasyonu kullanılarak, MSC’ler immünofenotiplendirildi ve loş ve boş ekspresyoncular tanımlandı. İmmünfenotiplerine göre alt popülasyonlar saf MSC’ler, tek pozitif ve çift negatif popülasyonlar olarak tanımlandı. Belirteçlerin diferansiyel ekspresyonunun in vitro kültür koşullarının bir eseri olup olmadığını veya fonksiyonel özellikler üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek için daha ileri fonksiyonel çalışmalar için saf ve zenginleştirilmiş alt popülasyonlar elde etmek için tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandılar. “Pozitif MSC belirteçlerinin” homojen ekspresörleri olmayan hücreler, fonksiyonel özelliklerini incelemek için sıralandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında, doğum sonrası kaynaklar arasında, oral doku kaynaklı MSC’ler, asgari etik yükümlülükleri ve dikkate değer çok soylu farklılaşma potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi çekmiştir21. Gömülü üçüncü azı dişinden ve SHED’lerden elde edilen diş pulpası kök hücreleri (DPSC’ler), nörodejeneratif ve travmatik hastalıklardaki terapötik potansiyelleri nedeniyle dental MSC’ler arasında en fazla ilgiyi görmüştür<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hindistan’ın Bengaluru kentindeki Jawaharlal Nehru İleri Bilimsel Araştırma Merkezi’ndeki Akış Hücresi Tesisi’ne akış sitometrisi çekirdek tesisinin kullanımı için teşekkür ederiz. Farklılaşmış hücrelerin pelet kültürünün kriyo-kesiti, Hindistan’ın Bengaluru kentindeki Neuberg Anand Referans Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Bu çalışma, UC’nin Hindistan’daki Manipal Yüksek Öğrenim Akademisi’nden (MAHE) okul içi finansmanı ile desteklenmiştir. AG, MAHE’den Dr. T. M. A. Pai Bursu’nun desteği için minnettardır.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- . . FACSAria Fusion User’s Guide. , (2018).
