Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion
Summary
Wir stellen eine Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen aus Lungenmetastasen vor, die ein chirurgisches Protokoll zur selektiven Photokonversion von Lungenmetastasen beinhaltet, gefolgt von der Identifizierung von redisseminierten Tumorzellen in tertiären Organen.
Abstract
Metastasen – die systemische Ausbreitung von Krebs – sind die häufigste krebsbedingte Todesursache. Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Zellen aus dem Primärtumor ausbreiten und Metastasen säen, können sich Tumorzellen in bestehenden Metastasen auch wiederausbreiten und neue Läsionen in tertiären Lokalisationen hervorrufen, in einem Prozess, der als “Metastasierung-von-Metastasen” oder “Metastasen-zu-Metastase-Seeing” bekannt ist. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben des Patienten beeinträchtigen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Prozesse hinter diesem Phänomen zu verstehen, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierendem Krebs zu verfeinern.
Über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen ist wenig bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien zur Metastasen-zu-Metastase-Aussaat stützen sich in erster Linie auf Sequenzierungsmethoden, die für Forscher, die den genauen Zeitpunkt von Metastasen-zu-Metastase-Seeding-Ereignissen untersuchen oder was sie fördert oder verhindert, möglicherweise nicht praktikabel sind. Dies unterstreicht den Mangel an Methoden, die die Untersuchung der Metastasen-zu-Metastasen-Aussaat erleichtern. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein murines chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Lungenmetastasen entwickelt und beschreiben es hier, das eine spezifische Markierung und Schicksalsverfolgung von Tumorzellen ermöglicht, die sich von der Lunge in tertiäre Stellen ausbreiten. Unseres Wissens ist dies die einzige Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen und der Aussaat von Metastasen zu Metastasen aus der Lunge, die keine Genomanalyse erfordert.
Introduction
Metastasen sind die häufigste krebsbedingte Todesursache1. Metastasierender Krebs entsteht, wenn sich Zellen des Primärtumors im ganzen Körper ausbreiten und sich zu klinisch nachweisbaren Tumoren in entfernten Organen vermehren 2,3.
Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Tumorzellen vom Primärtumor aus ausbreiten und entfernte Organe besiedeln4, deuten immer mehr klinische und experimentelle Beweise darauf hin, dass ein komplexerer, multidirektionaler Prozess im Spiel ist. Es hat sich gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen den Primärtumor wieder einsäen können (falls noch vorhanden)5,6,7,8,9, und Tumorzellen aus bestehenden metastasierten Herden können zu tertiären Stellen wandern und neue Läsionen hervorrufen 10,11,12,13. Tatsächlich deuten neuere Genomanalysen darauf hin, dass einige metastasierende Läsionen nicht vom Primärtumor, sondern von anderen Metastasen stammen – ein Phänomen, das als “Metastasierung von Metastasen” oder “Metastasen-zu-Metastase-Seeing” bekannt ist14,15,16. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann den Krankheitsprozess auch nach der Entfernung des Primärtumors fortsetzen, die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben der Patienten verringern. Daher ist das Verständnis der Prozesse, die hinter der Aussaat von Metastasen zu Metastasen stehen, von entscheidender Bedeutung, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierender Erkrankung zu verfeinern.
Trotz der potenziell schwerwiegenden klinischen Auswirkungen ist nur wenig über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien am Menschen sind durch einen Mangel an klinischen Proben begrenzt. Klinische Resektionen und Biopsien von metastasierten Läsionen sind selten, ebenso wie die Biopsie von scheinbar gesunden Organen, in denen einzelne gestreute Tumorzellen lauern können. Das bedeutet, dass Studien am Menschen in der Regel nur mit Autopsieproben von Personen möglich sind, deren Primärtumoren entweder noch vorhanden sind oder zuvor reseziert wurden, aber den Forschern noch zur Verfügung stehen. Wenn solche Proben verfügbar sind, müssen Abstammungsanalysen der Krebsprogression mit Hilfe von Sequenzierungsmethodendurchgeführt werden 14. Die Massensequenzierung von übereinstimmenden Primärtumoren und Metastasen hat jedoch nicht die Sensitivität, die für eine umfassende Abstammungsverfolgung erforderlich ist. Zum Beispiel kann die Massensequenzierung einer Läsion einen Subklon aufdecken, der in keiner seiner passenden Läsionen nachweisbar ist. In diesem Fall wäre es nicht möglich, die Herkunft dieses Subklons zu bestimmen. Es kann im Primärtumor oder in einer anderen Metastase mit einer Häufigkeit unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden gewesen sein, oder es kann nach der anfänglichen Kolonisierung der metastasierten Läsion entstanden sein, in der es gefunden wurde. Die Einzelzellsequenzierung bietet eine erhöhte Empfindlichkeit, aber ihre hohen Kosten schränken die großflächige Anwendung dieser Technik ein. Der retrospektive Charakter dieser Studien bedeutet auch, dass sie nur begrenzte Einblicke in transiente metastasierende Ereignisse und die Krankheitslandschaft zu verschiedenen Zeitpunkten bieten.
In Tiermodellen ermöglichen die jüngsten technologischen Fortschritte nun eine prospektive phylogenetische Kartierung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung 17,18,19,20. Diese Techniken nutzen die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung, um Zellen mit einem sich entwickelnden Barcode zu manipulieren – vererbbare Mutationen, die sich im Laufe der Zeit ansammeln. Bei der Sequenzierung kann die Abstammung jeder Zelle anhand des Mutationsprofils ihres Barcodes 17,18,19,20 zurückverfolgt werden. Tatsächlich wird eine solche Technologie bereits eingesetzt, um die Aussaat von Metastasen zu Metastasen abzubilden. In einer kürzlich erschienenen Arbeit zeigten Zhang et al., dass Brust- und Prostatakrebszellen in Knochenmetastasen aus dem Knochen zu sekundären Metastasen in mehreren Organen zurückkehren21.
Während diese neuartigen Methoden ein großes Potenzial haben, detaillierte, hochauflösende phylogenetische Karten der Krebsprogression zu erstellen, sind sie höchst unpraktisch für diejenigen, die den genauen Zeitpunkt von Metastasierungs-zu-Metastasen-Seeing-Ereignissen untersuchen und was sie fördert oder verhindert. Die Schließung dieser Wissenslücken ist von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis und die Behandlung von metastasierendem Krebs zu verfeinern, aber es gibt einen deutlichen Mangel an Technologien, die solche Studien ermöglichen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir kürzlich eine neuartige Technik entwickelt, die es uns ermöglicht, Tumorzellen durch Photokonversion in einer metastasierten Stelle (der Lunge) spezifisch zu markieren und sie anschließend in tertiären Organen zu reidentifizieren. Mit dieser Technik haben wir kürzlich gezeigt, dass sich Brustkrebszellen aus Lungenmetastasen und Seed-Tertiärorganen reseminieren13. Diese Technik kann auch verwendet werden, um den Zeitpunkt von Redisseminationsereignissen innerhalb eines engen Zeitfensters zu bestimmen und redisseminierte Tumorzellen zu quantifizieren, was die Untersuchung des Organotropismus von redisseminierten Zellen und der Frage, was die Redissemination fördert/verhindert, erleichtert.
Während Photokonversion und lokal induzierbare cre/lox-Systeme, die ein fluoreszierendes Protein dauerhaft durch ein anderes ersetzen, bereits zuvor zur Markierung und Verfolgung von Tumorzellen verwendet wurden 11,22,23, wurde unseres Wissens nach kein Ansatz für die räumlich-zeitliche Markierung von Tumorzellen optimiert, um auf die Lunge abzuzielen – eine der häufigsten Metastasierungsstellen bei Männern und Frauen, bei denen eine der 14 häufigsten Krebsarten diagnostiziert wurde 24. Jeder Krebszelltyp und jedes Protokoll zur Generierung von Lungenmetastasen kann mit unserem Verfahren verwendet werden, was es für Metastasenforscher allgemein nützlich macht. Alle Krebszellen, die zur Bildung von Lungenmetastasen verwendet werden, sollten ein photokonvertierbares oder photoschaltbares Protein exprimieren, und die Forscher können je nach ihren spezifischen Bedürfnissen und Ressourcen auswählen, welches Protein sie verwenden möchten. In dieser Studie verwendeten wir 6DT1-Brustkrebszellen, die stabil das photokonvertierbare grün-rot fluoreszierende Protein Dendra2 (6DT1-Dendra2-Zellen)25 exprimierten, das an das Histon H2B gebunden war. Wir injizierten 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-Zellen in das vierte Brustfettpolster weiblicher Rag2-/- Mäuse. Die Primärtumoren waren zwischen 12 und 16 Tagen nach der Injektion tastbar und wurden für die Dauer des Experiments nicht reseziert. Spontane Lungenmetastasen entwickelten sich zwischen 19 und 26 Tagen nach der Injektion von Tumorzellen. Photokonversionsoperationen wurden zwischen 26 und 29 Tagen nach der Injektion der Tumorzellen durchgeführt. Die Mäuse wurden 72 Stunden nach der Operation aufgrund der Belastung durch Lungenmetastasen getötet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Tumorzellen in der Lunge. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, Tumorzellen in der Lunge selektiv zu markieren und ihr Schicksal zu verfolgen, indem sie sie zu einem späteren Zeitpunkt im ganzen Körper neu identifizieren, was die Untersuchung der Metastasierung von Lungenmetastasen erleichtert. Mit diesem Protokoll war es möglich, photokonvertierte Zellen im Gehirn, in der Leber und in der nicht photokonvertierten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Wade Koba für seine Unterstützung bei der Mikro-Computertomographie (S10RR029545), Vera DesMarais und Hillary Guzik von der Analytical Imaging Facility für ihre Ausbildung und Unterstützung bei der Mikroskopie, dem Einstein Montefiore Cancer Center, dem National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), dem Gruss Lipper Biophotonics Center, dem Integrated Imaging Program for Cancer Research, ein Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z) und einen METAvivor Career Development Award.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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