光変換を用いた肺転移からの腫瘍細胞播種の追跡
Summary
肺転移の選択的光変換のための外科的プロトコルを含む肺転移からの腫瘍細胞の再分配を研究する方法を提示し、続いて第三次臓器における再播種性腫瘍細胞の同定を行います。
Abstract
転移(がんの全身性広がり)は、がん関連死の主な原因です。転移は、原発腫瘍の細胞が播種して転移を播種する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが、既存の転移の腫瘍 細胞も再播種し、「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られるプロセスで三次部位に新しい病変を生じさせる可能性があります。転移から転移への播種は、転移の負担を増加させ、患者の生活の質および生存率を低下させる可能性がある。したがって、この現象の背後にあるプロセスを理解することは、転移性がん患者の治療戦略を洗練させるために重要です。
転移から転移への播種については、物流上および技術上の限界もあって、ほとんど知られていない。転移から転移への播種に関する研究は、主にシーケンシング法に依存しており、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングや、それらを促進または防止するものを研究する研究者にとっては実用的ではない可能性があります。これは、転移から転移への播種の研究を容易にする方法論の欠如を浮き彫りにしています。これに対処するために、我々は、肺転移の選択的光変換のためのマウス外科的プロトコルを開発し、本明細書に記載し、肺から三次部位に再播種する腫瘍細胞の特異的マーキングと運命追跡を可能にする。私たちの知る限り、これは腫瘍細胞の再播種と肺からの転移から転移への播種を研究するための唯一の方法であり、ゲノム解析を必要としません。
Introduction
転移は、がん関連死の主な原因です1。転移性がんは、原発腫瘍の細胞が全身に播種し、遠隔臓器の臨床的に検出可能な腫瘍に増殖するときに発生します2,3。
転移は、腫瘍細胞が原発腫瘍から播種し、離れた臓器にコロニーを形成する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが4、臨床的および実験的証拠の増加は、より複雑で多方向のプロセスが作用していることを示唆しています。循環腫瘍細胞は原発腫瘍を再播種することができ(まだ存在する場合)5,6,7,8,9、および既存の転移性病巣からの腫瘍細胞が三次部位に移動して新しい病変を引き起こす可能性があることが示されています10,11,12,13.実際、最近のゲノム解析からの証拠は、一部の転移性病変が原発腫瘍からではなく、他の転移から生じることを示唆しています-「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られる現象14,15,16。転移から転移への播種は、原発腫瘍を切除した後でも疾患プロセスを永続させ、転移負荷を増加させ、患者の生活の質と生存率を低下させる可能性があります。したがって、転移から転移への播種の背後にあるプロセスを理解することは、転移性疾患患者の治療戦略を洗練させるために重要です。
潜在的に重篤な臨床的影響にもかかわらず、転移から転移への播種についてはほとんど知られていない、一部は物流上および技術上の限界のためである。ヒトでの研究は、臨床サンプルの不足によって制限されています。転移性病変の臨床的切除および生検は、単一の播種性腫瘍細胞が潜んでいる可能性のある一見健康な臓器の生検と同様にまれである。つまり、ヒトでの研究は、通常、原発腫瘍がまだ残っているか、以前に切除されたが研究者がまだ利用できる個人の剖検サンプルを使用してのみ可能です。そのような試料が入手可能な場合、癌進行の系統解析は、配列決定法を用いて実施されなければならない14。しかしながら、一致した原発腫瘍および転移の一括シーケンシングは、包括的な系統追跡に必要な感度を有していない。例えば、1つの病変のバルクシーケンシングにより、一致した病変のいずれでも検出できないサブクローンが明らかになることがあります。この場合、このサブクローンの起源を特定することはできません。原発腫瘍または別の転移に検出限界を下回る頻度で存在していたか、またはそれが発見された転移性病変の最初のコロニー形成後に発生した可能性があります。シングルセルシーケンシングは感度を向上させますが、コストが高いため、この手法の大規模な適用は制限されます。これらの研究のレトロスペクティブな性質は、一過性の転移事象と異なる時点での疾患の状況に関する洞察が限られていることも意味します。
動物モデルでは、最近の技術の進歩により、高い空間的および時間的分解能を備えた前向き系統発生マッピングが可能になりました17,18,19,20。これらの技術は、CRISPR/Cas9ゲノム編集を利用して、進化するバーコード(時間の経過とともに蓄積する遺伝性変異)を持つ細胞を操作します。シーケンシングでは、バーコード17、18、19、20の突然変異プロファイルに基づいて各細胞の系統をたどることができます。実際、このような技術は、転移から転移への播種をマッピングするためにすでに使用されています。最近の論文で、Zhangらは、骨転移中の乳がん細胞と前立腺がん細胞が骨から再播種し、複数の臓器に二次転移を播種することを実証しました21。
これらの新しい方法は、がんの進行に関する詳細で高解像度の系統図を作成する大きな可能性を秘めていますが、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングと、それらを促進または予防するものを研究している人にとっては、非常に実用的ではありません。これらの知識のギャップを埋めることは、転移性がんの理解と治療を洗練させるために不可欠ですが、そのような研究を促進するための技術が著しく不足しています。このニーズに対処するために、私たちは最近、転移部位(肺)の光変換を介して腫瘍細胞を特異的にマーキングし、その後三次臓器でそれらを再識別できる新しい技術を開発し、ここに提示します。この手法を用いて、我々は最近、乳がん細胞が肺転移から再播種し、第三次臓器に種をまくことを示した13。この手法は、狭いウィンドウ内で再播種イベントのタイミングを決定し、再播種した腫瘍細胞を定量するためにも使用でき、再播種された細胞の器官向性および再播種を促進/防止するものの研究を容易にします。
ある蛍光タンパク質を別の蛍光タンパク質に恒久的に置き換える光変換および局所誘導性cre/loxシステムは、腫瘍細胞のマーキングと追跡に以前に使用されてきましたが11,22,23、私たちの知る限り、腫瘍細胞の時空間マーキングのアプローチは、最も一般的な14の癌のいずれかと診断された男性と女性の間で最も一般的な転移部位の1つである肺を標的にするように最適化されていません24.肺転移生成のためのあらゆるがん細胞タイプとプロトコルを私たちの手順で使用することができ、転移研究者にとって広く有用です。肺転移の生成に使用されるすべてのがん細胞は、光変換性または光切り替え可能なタンパク質を発現する必要があり、研究者は特定のニーズとリソースに基づいて使用するタンパク質を選択できます。本研究では、ヒストンH2Bにタグ付けされた光変換可能な緑色から赤色の蛍光タンパク質Dendra2(6DT1-Dendra2細胞)25を安定に発現する6DT1乳癌細胞を用いた。雌のRag2-/-マウスの4番目の乳腺脂肪パッドに5.0×104 6DT1-Dendra2細胞を注入した。原発腫瘍は注射後12〜16日の間に触知可能であり、実験期間中は切除されなかった。自然肺転移は、腫瘍細胞注射後19〜26日の間に発症した。光変換手術は、腫瘍細胞注射後26〜29日の間に行われました。マウスは、肺転移の負担のために術後72時間までに犠牲にされました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文では、肺の腫瘍細胞の選択的光変換のための外科的プロトコルについて説明します。この技術により、研究者は肺の腫瘍細胞を選択的にマークし、後で全身で腫瘍細胞を再識別することでその運命を追跡することができ、肺転移からの転移の研究が容易になります。このプロトコルを用いて、光変換手術を行ったマウスの脳、肝臓、非光変換右肺の光変換細胞を可視化することがで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マイクロコンピュータ断層撮影(S10RR029545)の支援をしてくれたWade Koba氏、顕微鏡検査のトレーニングと支援をしてくれたAnalytical Imaging FacilityのVera DesMarais氏とHillary Guzik氏、アインシュタイン・モンテフィオーレがんセンター、国立がん研究所(P30CA013330、R01CA21248、R01CA255153)、Gruss Lipper Biophotonics Center、Integrated Imaging Program for Cancer Research、 サー・ヘンリー・ウェルカム・ポスドク・フェローシップ(221647/Z/20/Z)、METAvivor Career Development Awardを受賞。
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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