Hidtil er protokoller til samtidig isolering af alle de vigtigste celletyper, der er hjemmehørende i centralnervesystemet, fra den samme mus et uopfyldt behov. Protokollen viser en procedure, der kan anvendes i naive og eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis-mus til at undersøge komplekse cellulære netværk under neuroinflammation og samtidig reducere det krævede museantal.
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige murinmodel for multipel sklerose (MS) og bruges ofte til yderligere at belyse den stadig ukendte ætiologi af MS for at udvikle nye behandlingsstrategier. Myelin oligodendrocytglycoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen reproducerer et selvbegrænsende monofasisk sygdomsforløb med stigende lammelse inden for 10 dage efter immunisering. Musene undersøges dagligt ved hjælp af et klinisk scoringssystem. MS drives af forskellige patomekanismer med et specifikt tidsmæssigt mønster, og derfor er undersøgelsen af centralnervesystemets (CNS) -residente celletypers rolle under sygdomsprogression af stor interesse. Det unikke ved denne protokol er samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper (mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og neuroner), der gælder hos voksne EAE og raske mus. Dissociationen af hjernen og rygmarven fra voksne mus efterfølges af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) for at isolere mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og neuroner. Flowcytometri blev anvendt til at udføre kvalitetsanalyser af de oprensede enkeltcellesuspensioner, hvilket bekræftede levedygtigheden efter celleisolering og indikerede renheden af hver celletype på ca. 90%. Afslutningsvis tilbyder denne protokol en præcis og omfattende måde at analysere komplekse cellulære netværk hos raske mus og EAE-mus på. Desuden kan antallet af påkrævede mus reduceres væsentligt, da alle fire celletyper isoleres fra de samme mus.
Multipel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) karakteriseret ved demyelinisering, aksonal skade, gliose og neurodegeneration. På trods af talrige forskningsmetoder på dette område er patofysiologien af MS stadig ikke fuldt ud forstået 1,2,3,4. Den mest almindelige dyremodel til undersøgelse af MS er myelin oligodendrocytglycoprotein peptid 35-55 (MOG35-55)-induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som deler mange af dets kliniske og patofysiologiske egenskaber 5,6,7,8,9 . Det er baseret på immunsystemets respons mod CNS-specifikke antigener, der fører til inflammation, demyelinering og neuroaxonal degeneration. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en passende model til undersøgelse af neuroinflammatoriske veje og signalkaskader fundet i MS.
De nuværende behandlingsmuligheder for MS er kun delvist effektive og fokuserer primært på sygdommens indledende inflammatoriske fase. Imidlertid synes den neurodegenerative komponent i MS at være den største udfordring for langsigtede terapeutiske tilgange. Derfor kræves reproducerbare og præcise celleisoleringsprotokoller for at undersøge molekylære og cellulære mekanismer i autoimmune sygdomme på en omfattende måde. Selv hvis der findes nogle protokoller til isolering af en enkelt celletype 10,11,12,13,14,15, er der et uopfyldt behov for samtidig isolering af flere CNS-residente cellepopulationer på én gang. Tidligere protokoller til isolering af CNS-residente celler mangler at bevare cellulær funktionalitet og renhed, hvilket resulterer i samdyrkning med naboceller 16,17,18 eller uegnethed til komplekse analyser af intracellulære netværk ex vivo 19,20,21,22.
Formålet med denne protokol var at etablere en reproducerbar og omfattende metode til samtidig isolering af rene levedygtige enkeltcellesuspensioner af alle de vigtigste CNS-residente celletyper, der kan anvendes i voksne raske mus og EAE-mus. De forskellige celletyper blev isoleret ved hjælp af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS)23. Celleseparationen kan opnås enten ved positiv selektion, dvs. magnetisk mærkning af celletypespecifikke overflademarkører eller ved negativ selektion via biotinylering og udtømning af alle uønskede celler. Flowcytometri blev anvendt for at sikre en renhed på over 90% og en levedygtighed på mindst 80% af de isolerede enkeltcellesuspensioner.
Afslutningsvis var hovedmålet at etablere en protokol til samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper som et alsidigt værktøj til undersøgelse af neuroinflammatoriske veje, der tilbyder en omfattende og præcis analyse af komplekse cellulære netværk og biokemiske signalkaskader hos raske mus og EAE-mus.
Indtil videre tilbyder metoder til kortlægning af CNS-residente celler ex vivo ved at kombinere massespektrometri og RNA-sekventering en meget præcis cellulær profilering inden for sundhed og sygdom, men kræver ambitiøs teknisk viden og ekspertise på dette område50,51. Desuden tillader de ikke funktionelle analyser og er meget dyre. Derudover giver mikrofluidiske hjerne-på-en-chip-systemer en hurtig og overkommelig screening for sygdomsmekanismer og test af nye terapeutiske tilgange med begrænsning af cellevækst og migration 52,53,54,55. CNS-organoider kunne også repræsentere et tilsvarende alternativ i fremtiden til undersøgelse af cellulær modellering, intercellulære forbindelser og interaktioner under sygdomsforløb 56,57,58,59. Imidlertid er fluorescens- og magnetaktiveret cellesortering i øjeblikket de mest effektive metoder til at generere rene og levedygtige enkeltcellesuspensioner ex vivo 35,60,61. Selv om andre etablerede fremstillingsprotokoller til isolering af CNS-residente celletyper ligner hinanden med hensyn til de enkelte trin i den magnetiske isolering og den forudgående celledissociation, er de beregnet til at blive udført separat for hver celletype. I modsætning hertil integrerer den nuværende protokol forskellige isolationsmetoder for hver CNS-resident celletype i en logisk sammenhæng, så de kan udføres samtidigt på én gang og fra en enkelt CNS-cellesuspension (tabel 1, tabel 2). Således muliggør det multi-omics-analyser fra en enkelt CNS-cellesuspension og i sidste ende udforskning af komplekse neuronale netværk. Selv om det ikke er et must at samle flere væv fra flere dyr for at udføre denne protokol, sikrer denne pooling et tilstrækkeligt antal isolerede celler til yderligere downstream-analyse. Brugen af forskellige mus til isolering af de enkelte celletyper ville udelukke muligheden for at analysere potentielle cellulære interaktioner. Derudover sparer kombinationen af individuelle isolationsmetoder for de forskellige CNS-celletyper, som alle følger en tidligere CNS-dissociation, materialeomkostninger ved at bruge en dissocieret CNS-cellesuspension til alle følgende magnetiske isolationstrin. Derudover minimeres en potentiel teknisk bias forårsaget af brugen af forskellige mus.
En begrænsning af protokollen kunne være den næsten eksklusive brug af kvindelige C57BL/6J-mus. EAE-immuniseringsprotokollen er designet og etableret til hunmus, så denne celleisoleringsprotokol blev også implementeret i kvindelige C57BL / 6J-mus. Ikke desto mindre blev naive hanmus også brugt under udviklingen af denne protokol uden at genkende nogen effekt på det resulterende celleantal eller renheder. En anden begrænsning påvirker neuronernes magnetiske celleisolering, da der ikke findes nogen specifikke mikroperler til isolering af neuroner med hensyn til en positiv udvælgelse. Det blev antaget, at en ren enkeltcellesuspension kunne opnås via biotinmærkning og udtømning af alle ikke-neuronale celler (tabel 2). Denne antagelse blev verificeret ved brugen af NeuN som en specifik nuklear markør for neuroner, integreret i det nævnte flowcytometrirenhedspanel. En anden begrænsning vedrører isolering af mikroglia i EAE-mus. Her reduceres resulterende celleudbytter sammenlignet med de andre celletyper på grund af det ekstra sorteringstrin efter MACS-protokollen. Desuden kan man argumentere for, at sortering øger mikrogliaens mekaniske belastning sammenlignet med de andre cellepopulationer. Individuelle sorteringsstrategier kan føre til forskellige mængder celleudbytter. Hvis det isolerede celleantal er mindre end forventet eller ønsket, anbefales det at justere gating-opsætningen og/eller forbedre diskriminationen mellem levende og døde.
Et kritisk trin i protokollen repræsenterer fjernelse af affald. Gradienten skal lagdeles meget langsomt og forsigtigt for at skabe de tre ønskede separate faser (figur 2A). Kun hvis myelin og andre rester af affald i de to øverste faser fjernes fuldstændigt (figur 2E), kan der dannes rene enkeltcellesuspensioner, og yderligere kontaminering kan reduceres. Hvis de resulterende cellesuspensioner mangler renhed, er dette sandsynligvis den del af protokollen, der først skal forbedres ved siden af forsikringen om den rigtige brug af alle mikroperler.
Modtagelse af høje niveauer i renhed og levedygtighed kan være udfordrende i denne type eksperiment. Nogle anbefalinger til fejlfinding er:
-Arbejde under sterile forhold er obligatorisk for at forhindre kontaminering af de forskellige mikroperler og muliggøre gentagen brug, især til efterfølgende dyrkning.
-Mærkning af hvert rør for at forhindre forveksling anbefales stærkt.
-Undgå brug af ukølede reagenser/buffere. Opbevar alle cellesuspensioner på is under hele eksperimentet for at sikre høj levedygtighed.
-Hold tiden mellem de forskellige arbejdstrin så kort som muligt. Der er ingen specifik del i protokollen, hvor det anbefales at sætte eksperimentet på pause.
-Det er yderst relevant at overholde de angivne inkubationsperioder.
Afslutningsvis giver denne nuværende protokol til samtidig isolering af alle de vigtigste CNS-residente celletyper fra en CNS-replikat mulighed for at analysere komplekse neuronale netværk og neuroinflammatoriske veje ex vivo fra en CNS-cellesuspension. Således kan CNS-residente celler undersøges i forskellige stadier af sygdomsforløb, fx under neuroinflammation, neurodegeneration og / eller remission i EAE. Desuden kan celle-celle-interaktioner og biokemiske veje studeres på individuelt niveau, og variabiliteten inden for eksperimentelle grupper kan reduceres. Der er også mulighed for at dyrke fraktioner af de isolerede CNS-celler i monokulturer til yderligere funktionelle assays og validering. Alt i alt tilbyder denne protokol betydelige fremskridt, der potentielt påvirker prækliniske og kliniske forskningsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Figurerne blev oprettet ved hjælp af Adobe Illustrator (version 2023) og Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes blev støttet af Jürgen Manchot Stiftung.
70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |