Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) fungerer som en dyremodell for multippel sklerose. Denne artikkelen beskriver en tilnærming for å score ryggmargsbetennelse, demyelinisering og aksonal skade i EAE. I tillegg presenteres en metode for å kvantifisere løselige nevrofilamentlysnivåer i musserumet, noe som letter vurderingen av aksonal skade hos levende mus.
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en vanlig immunbasert modell for multippel sklerose (MS). Denne sykdommen kan induseres hos gnagere ved aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskjeden og Complete Freunds adjuvans (CFA) eller ved overføring av myelinspesifikke T-effektorceller fra gnagere primet med myelinprotein/CFA til naive gnagere. Alvorlighetsgraden av EAE skåres vanligvis på en 5-punkts klinisk skala som måler graden av stigende lammelse, men denne skalaen er ikke optimal for å vurdere omfanget av utvinning fra EAE. For eksempel forblir kliniske score høy i noen EAE-modeller (f.eks. myelinoligodendrocyttglykoprotein [MOG] peptidindusert modell av EAE) til tross for opphør av betennelse. Det er derfor viktig å komplementere klinisk skåring med histologisk skåring av EAE, som også gir et middel til å studere de underliggende mekanismene for cellulær skade i sentralnervesystemet (CNS).
Her presenteres en enkel protokoll for å forberede og flekke ryggmargs- og hjerneseksjoner fra mus og for å score betennelse, demyelinisering og aksonal skade i ryggmargen. Metoden for å score leukocyttinfiltrasjon i ryggmargen kan også brukes til å score hjernebetennelse i EAE. En protokoll for måling av løselig nevrofilamentlys (sNF-L) i serum hos mus ved bruk av en SIMOA-analyse (Small Molecule Assay) er også beskrevet, som gir tilbakemelding på omfanget av total CNS-skade hos levende mus.
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den vanligste murinmodellen for den humane demyeliniserende sykdommen, multippel sklerose (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, inkludert infiltrasjon av IFN-γ (gamma) og IL-17-produserende T-hjelperceller2, infiltrasjon av inflammatoriske monocytter3, dannelse av perivaskulære og submeningeale inflammatoriske demyeliniserende lesjoner4 og forekomsten av aksonskade4 i sentralnervesystemet (CNS), observeres også i EAE 5,6,7,8,9. Likheten i immunmekanismer mellom EAE og MS har gjort EAE til en egnet preklinisk modell for testing av effekt og virkningsmekanismer av en rekke godkjente immunbaserte terapier for MS, inkludert natalizumab, fingolimod, dimetylfumarat og glatirameracetat (gjennomgått i 1,5). Visse EAE-regimer modellerer andre aspekter av progressiv MS-patologi utover aksonal skade, inkludert utvikling av submeningeal betennelse i hjernen, kronisk demyelinisering, ryggmargsatrofi, synapse og nevrontap 6,10,11,12. Dermed har EAE nytte for screening effekten av nevrobeskyttende terapier for MS.
EAE induseres hos gnagere på en rekke måter. Aktiv immunisering er den vanligste induksjonsmetoden og innebærer immunisering av gnagere med myelinantigener (enten hele proteiner eller peptider) emulgert i CFA supplert med varmedrept Mycobacterium tuberculosis13. Avhengig av musens belastning, administreres kikhostetoksin (PTX) også på dag 0 og dag 2 av immunisering for å øke penetransen av sykdom13. EAE kan også induseres ved adoptivoverføring av myelinspesifikke T-celler oppnådd fra myelin/CFA-primede mus til friske mus14 eller kan utvikle seg spontant hos mus som overuttrykker T-cellereseptorer som er spesifikke for de viktigste myelinantigenene5.
EAE sykdom alvorlighetsgrad og progresjon er vanligvis scoret ved hjelp av en diskret 5-punkts klinisk skala: 1 – hale limpness, 2 – baklem eller fot svakhet, 3 – fullstendig lammelse i en eller begge baklemmer, 4 – forbenet svakhet, 5 – døende eller død13. Dette kliniske skåringssystemet er godt for å dokumentere progresjonen av stigende lammelse som oppstår ved sykdomsdebut, men er mindre følsom for å fange omfanget av utvinning fra CNS-inflammatoriske angrep. For eksempel er både mus som ambulerer med vanskeligheter og mus som ambulerer lett, men viser fotgripende svakhet, tildelt en score på 2 på EAE-skalaen. Score kan forbli høy i den postakutte fasen av EAE på grunn av tilstedeværelsen av permanent aksonskade eller tap, selv til tross for oppløsningen av den inflammatoriske responsen9. Det har vært en rekke forsøk på å utvikle mer raffinerte scoring systemer, atferdstester, målinger av baklemmer og grep styrke, og infrarøde overvåkingssystemer for bedre å fange forskjeller i kliniske underskudd i EAE 9,16,17,18; Disse mer intrikate skåringsmålene skiller imidlertid ikke bidraget fra inflammasjon versus vevsskade til de underliggende nevrologiske utfallene. Dermed er gullstandardtilnærmingen for å score alvorlighetsgraden av EAE å utføre både klinisk og histologisk scoring.
Her beskrives en protokoll for hvordan man dissekerer og legger inn museryggmarg og hjerneprøver i parafin på en måte som fanger den stokastiske prosessen med lesjonsdannelse som oppstår i EAE. Det presenteres også en protokoll for hvordan man flekker seksjoner med Luxol fast blue (LFB), opprinnelig laget av Kluver og Barrera19, som oppdager myelin i CNS. Seksjoner er enten farget med LFB alene (for demyeliniseringsanalyse) eller er motfarget med hematoksylin og eosin (H &E) for å visualisere og score inflammatoriske lesjoner. Protokoller er også gitt for å kvantifisere tilstedeværelsen av totale leukocytter (CD45), tap av myelin, og antall skadede aksoner (SMI-32) i ryggmargen ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer, immunhistokjemiske (IHC) teknikker og offentlig tilgjengelig programvare. Protokollen som brukes til å kvantifisere leukocytter i ryggmargen, kan også brukes til å kvantifisere leukocytter i hjernen.
Histologisk evaluering av aksonalt tap og skade i hjernen er relativt vanskeligere enn i ryggmargen, siden hjernens hvite substanskanaler ikke løper parallelt med hverandre. Måling av serumnevrofilamentlys (sNF-L) har dukket opp som en lovende biomarkør for nevronskade i MS20,21. Nylige studier har utvidet denne teknologien til EAE 22,23,24. Her presenteres en metode for å måle serum nevrofilament lys (sNF-L) i levende mus ved hjelp av en Small Molecule Assay (SIMOA) analyse. Denne metoden krever bare en liten mengde serum og kan gjøres i levende mus på bare en halv dag, og gir rask tilbakemelding på hvordan en testet terapi påvirker den generelle CNS-skaden. Alle metodene beskrevet her kan brukes på mus av noe kjønn eller stamme.
Histologisk farging av ryggmargen er et viktig verktøy for å vurdere alvorlighetsgraden av EAE-sykdommen, spesielt i tilfeller der det er forskjeller mellom behandlingsgruppene i graden av sykdomsbedring i den postakutte sykdomsfasen. Farging for immuncelleinfiltrasjon (CD45), myelin (LFB) og aksonal skade (SMI-32) bidrar til å karakterisere den underliggende årsaken til de endrede kliniske resultatene hos mus. Den histologiske fargeprotokollen beskrevet her gir et perspektiv på inflammasjon samt omfanget av myelin- og aksonal skade. Videre viste resultatene validere sNF-L-måling som en metode for å vurdere omfanget av total nevronskade i EAE.
De kritiske parametrene for denne analysen er å sikre at etterforskerne er blindet for identiteten til seksjonene og at det er tilsvarende prøvetaking på hvert nivå av ryggmargen over de forskjellige musene. Dette skyldes at alvorlighetsgraden av betennelse kan være større ved lavere nivåer av ledningen. En annen kritisk parameter er størrelsen på eksperimentelle grupper. Ryggmarg og hjerne høstes typisk fra 6–8 mus per gruppe ved endepunktet for å se signifikante forskjeller mellom grupper med behandlinger eller genotyper med beskjedne effektstørrelser. Det er også viktig å sikre at utvalgte mus, når de er gjennomsnittet, har representative gjennomsnittlige score for hele gruppen. Når det gjelder feilsøking, er et vanlig problem som oppstår av de som er uerfarne med protokollen, at ryggmargen er fast i utilstrekkelig lang tid, og det er ikke lett ekstrudert fra ryggraden. Hvis dette er tilfelle, kan ryggmargen manuelt dissekeres fra kolonnen ved å klippe langs de spinøse prosessene ved hjelp av fin saks og åpne kolonnen for å avsløre ryggmargen. Alternativt kan vev fikses i noen ekstra dager uten å forstyrre suksessen med antistofffarging. Antistoffklonene som er beskrevet her virker i vev festet opptil 2 uker i formalin.
Embedding ryggmargen stykker krever dyktighet og praksis. Det anbefales at øyeluper brukes og en lampe rettes over innebyggingsstasjonen for bedre å visualisere om seksjonene faller i tverrsnitt eller i langsgående seksjon. Å holde lengdene på ryggmargsbitene på mindre enn 2 mm under inntjening vil hjelpe dem å falle i tverrsnitt. Et annet vanlig problem som oppstår for mindre erfarne brukere er at LFB fordamper under inkubasjonen over natten, og etterlater halvparten av lysbildet farget og halvparten ufarget. For å unngå fordampning, bør glassfatet forsegles med termoplastfilm og deretter plastfolie. Hvis fordampning oppstår og seksjoner er ujevnt farget, anbefales det å fjerne lysbildene helt med litiumkarbonat og flekke dem igjen i LFB over natten. Et annet vanlig problem er at brukerne ikke helt de-blå den grå substansen etter LFB. Det er viktig å undersøke individuelle seksjoner under mikroskopet for å sikre at en tilstrekkelig mengde de-bluing er nådd før du fortsetter med andre trinn i protokollen. I tillegg, selv om CD45 og SMI-32 IHC-flekkene fungerer robust, er det fortsatt viktig å feilsøke antistoffkonsentrasjoner i innledende eksperimenter for hvert nytt antistoffparti mottatt. Dette kan gjøres ved å teste en rekke konsentrasjoner av antistoffet på en positiv kontrollseksjon (EAE ryggmarg). Førstegangsfarging bør også inkludere en negativ kontroll som består av sekundært antistoff alene uten tilsatt primærantistoff. Til slutt er det kritisk i bildeanalysen å terskelere enkeltbilder, da farging kan være ujevn på tvers av lysbilder eller seksjoner.
Denne protokollen bruker fritt tilgjengelig programvare. Hvis man ikke har tilgang til en prosessor, en embedder eller mikrotom, kan disse trinnene hentes til en sykehusbasert patologikjerne som tilbyr disse tjenestene. Også, hvis man ikke har tilgang til en lysbildeskanner, kan man bruke et lysmikroskop som er utstyrt med et videokamera for å lagre TIFF-bilder av ryggmargen eller hjerneregionene. For en mikroskopbasert arbeidsflyt, ta LFB- eller LFB / H&E-seksjoner ved lav effekt (40x forstørrelse) og for CD45- og SMI-32-farging, avbilde minst fire vinduer som er sentrert i ventrale, dorsale og laterale deler av ryggmargen (200x forstørrelse for CD45 og 400x forstørrelse for SMI-32). Bildeanalyse kan utføres på disse bildene for å kvantifisere farging på en lignende måte som beskrevet.
Beslutningen om hvilken histologisk tilnærming som skal tas for å skåre EAE er avhengig av hvor mye de kliniske skårene varierer mellom gruppene. For eksempel, hvis det er drastiske forskjeller i EAE klinisk score (en gruppe fikk EAE og en ikke), er dette vanligvis relatert til forskjeller i perifer mediert inflammasjon. I dette tilfellet er skåring for tilstedeværelse av demyeliniserende lesjoner på LFB/H&E-fargede seksjoner tilstrekkelig og vil avsløre forskjeller mellom grupper. Hvis gruppene er likere i klinisk skår ved debut, og det i stedet er forskjeller i graden av klinisk bedring (f.eks. eksperiment i figur 5A), er det best å bruke hele den histologiske arbeidsflyten som er skissert her, inkludert skåring av hjernebetennelse i hjernestammen og lillehjernen, for å skille om forskjellene i sykdomskronisitet er relatert til forskjeller i inflammasjon eller vevsskade. Hvis forskjeller i inflammasjon blir funnet vurdert ved CD45-telling, kan ytterligere IHC-studier gjøres for å farge for T-celler (anti-CD3), infiltrerende monocytt/makrofager (Mac3) og mikroglia (Iba-1/TMEM119) (anbefalte antistoffkloner finnes i tilleggstabell 3). Aktivering av mikroglia reflekteres av en økning i intensiteten av Iba-1-farging på dobbeltmerket Iba-1+TMEM-19+ mikroglia og en økt tilbaketrekning av mikrogliaprosesser som kan vurderes ved Sholl analyse på seksjon32. Videre kan teknikker som flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering brukes til å gjennomføre en dypere karakterisering av frekvensen og fenotypen av immunpopulasjoner i hjernen og ryggmargen.
Telling av SMI-32+ aksoner er en sensitiv metode for å oppdage aksonskade i EAE32,33 og i MS34. SMI-32, som oppdager den ikke-fosforylerte formen av nevrofilament tung eller middels, akkumuleres i endepærer av transekterte nevroner. Et alternativ til å oppdage skadede aksoner er å farge med amyloidforløperprotein (APP) som kan akkumuleres i aksoner som følge av forstyrret aksontransport33. Mønsteret av farging for SMI-32 og APP, selv om begge begge reflekterer aksonskade, overlapper vanligvis ikke, noe som indikerer at de oppdager forskjellige patologier33. Man kan også komplementere histologiske mål på aksonskade ved å måle sNF-L, som er et raskt og sensitivt mål på pågående aksonal skade i både ryggmargen og hjernen. Det gir fordelen at det kan gjøres på en halv dag i levende mus. En ulempe med denne metoden er at settene er dyre og maskinen er svært spesialisert. Selskapet som selger sNF-L-settet tilbyr et gebyr for service for de som ikke har tilgang til en SIMOA-maskin. Et alternativ til å vurdere aksonskade er å skåre for aksontap ved enten å telle aksoner i toluidinblåfargede seksjoner av ryggmargen12 eller telle nevrofilamentbunter påvist av SMI-31 i områder av ryggmargens hvit substans32. Begge disse er mer arbeidskrevende tilnærminger enn SMI-32 eller sNF-L-måling.
Hvis EAEs kliniske skår varierer mellom gruppene, men skår for inflammasjon, demyelinisering og aksonal skade ikke viser forskjeller mellom gruppene, kan det være nyttig å flekke for astrocytaktivering ved bruk av GFAP (se tilleggstabell 3 for anbefalt antistoffklon). Astrocytaktivering er assosiert med en økning i GFAP-farging, og dette har vist seg å korrelere med EAE-progresjon i noen EAE-modeller, inkludert kronisk EAE i DA-rotte35.
Avslutningsvis beskriver denne protokollen metoder og gir en analysearbeidsflyt for å utføre histologisk scoring av EAE.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Raymond Sobel (Stanford University) for å vise oss sin metode for innbringende og fikse hjerne- og ryggmargsseksjoner. Vi takker Kyle Roberton og Milan Ganguly fra Toronto Centre for Phenogenomics for å lære innebyggingsmetoden og for å kutte så mange av våre hjerne- og ryggmargsseksjoner. Vi takker Dr. Matthew Cussick og Dr. Robert Fujinami (University of Utah) for å dele sine protokoller for å score submeningeal og perivaskulær betennelse i ryggmargen. Vi takker Shalina Ousman for å dele klonen av CD45 antistoff. Vi takker Xiofang Lu for opplæring på vevsprosessoren og vevsinnbyggingsstasjonen og vedlikehold av dette utstyret ved Keenan Research Center of Biomedical Research ved St. Michael’s Hospital. Dette arbeidet ble støttet av et biomedisinsk stipend fra MS Canada (til SED). Carmen Ucciferri støttes av et studentskap fra Canadas regjering. Nuria Alvarez-Sanchez støttes av et postdoktorstipend fra Keenan.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |