أغماد الذرة المنفصلة لتصوير الخلايا الحية للعدوى بمسببات أمراض الذرة الورقية الفطرية
Summary
تفصل هذه المخطوطة بروتوكول التلقيح الأمثل الذي يستخدم أغماد أوراق الذرة المنفصلة للدراسات الخلوية والفسيولوجية والجزيئية القابلة للتكرار لتفاعلات الذرة مع مسببات الأمراض النباتية الفطرية. تسهل أغماد الأوراق المراقبة في الوقت الفعلي للتفاعلات الخلوية بين النبات الحي والفطريات في الأنسجة غير الثابتة.
Abstract
لقد قمنا بتحسين بروتوكول لتلقيح أغماد أوراق الذرة بالفطريات المسببة للأمراض الورقية ذاتية التغذية والميتة. تم تعديل الطريقة من طريقة تم تطبيقها في الأصل على أغلفة أوراق الأرز وتسمح بالمراقبة المجهرية المباشرة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية. يتم تلقيح أغماد الأوراق التي يتم جمعها من شتلات الذرة مع اثنين من أطواق الأوراق الناشئة بالكامل بقطرات 20 ميكرولتر من 5 × 105 جراثيم / مل معلقات جراثيم فطرية وحضنها في غرف الرطوبة عند 23 درجة مئوية تحت ضوء الفلورسنت المستمر. بعد 24-72 ساعة ، تتم إزالة الأنسجة الزائدة بشفرة حلاقة لترك طبقة واحدة من خلايا البشرة ، وهي عينة واضحة بصريا يمكن تصويرها مباشرة دون الحاجة إلى التثبيت الكيميائي أو التطهير. تبقى الخلايا النباتية والفطرية على قيد الحياة طوال مدة التجربة ويمكن تصور التفاعلات في الوقت الفعلي. يمكن تلطيخ الأغماد أو تعريضها لانحلال البلازما لدراسة علم الخلايا النمائي وصلاحية الخلايا المضيفة والممرضة أثناء العدوى والاستعمار. يمكن تلقيح السلالات الفطرية التي تم تحويلها للتعبير عن البروتينات الفلورية أو تلقيحها بشكل مشترك على الأغماد لزيادة الدقة ولتسهيل تقييم التفاعلات التنافسية أو التآزرية. يمكن استخدام السلالات الفطرية التي تعبر عن بروتينات الاندماج الفلورية لتتبع وقياس إنتاج واستهداف هذه البروتينات الفردية في لسان النبات. يمكن استخلاص أنسجة الغلاف الملقحة لتوصيف الأحماض النووية أو البروتينات أو الأيضات. أدى استخدام مقايسات الغمد هذه إلى تقدم كبير في الدراسات التفصيلية لآليات الإمراضية الفطرية في الذرة وكذلك مستجيبات البروتين الفطري والمستقلبات الثانوية التي تساهم في الإمراضية.
Introduction
تعتبر التحليلات المكانية والزمانية على المستوى الخلوي ضرورية لفهم فسيولوجيا وعلم الخلايا للتفاعلات الفطرية النباتية. تم استخدام الأنسجة الورقية التي تم تثبيتها كيميائيا1،2،3أو تطهيرها وتلوينها4 ، وكذلك الأغشية الاصطناعية5 ، في الماضي للتحقيق في علم الخلايا لتطور مسببات الأمراض الورقية والتفاعلات الفطرية النباتية. ومع ذلك ، فإن التحقيق في أحداث العدوى في أنسجة المضيف الحي في الوقت الفعلي دون تثبيت أو إزالة يمثل تحديا بسبب المشكلات الفنية المتعلقة بإعداد عينات شفافة بصريا للتصوير.
تم تطوير بروتوكول تلقيح غمد الأوراق المنفصل في أواخر أربعينيات القرن العشرين للتحقيق المجهري الميداني الساطع لمقاومة خلايا بشرة الأرز الحية لفطر انفجار الأرز Magnaporthe oryza6. في الآونة الأخيرة ، تم تسهيل الملاحظات الجزيئية والفسيولوجية والخلوية التفصيلية لاستعمار المضيف بواسطة أنواع Colletotrichum و Magnaporthe بشكل كبير من خلال الجمع بين الإصدارات المعدلة من طريقة غمد الأوراق هذه مع المحولات الفطرية التي تعبر عن البروتينات الفلورية ، وبروتوكولات تصوير الخلايا الحية عالية الأداء ، بما في ذلك التألق والمجهر متحد البؤر7،8،9،10 ،11,12,13.
يفصل هذا البحث بروتوكول التلقيح الأمثل باستخدام أغلفة أوراق الذرة المنفصلة لمراقبة عمليات العدوى بواسطة مسببات الأمراض الفطرية الورقية والميتة. لقد استخدمناه على وجه التحديد لدراسة Colletotrichum graminicola (C. graminicola) ، العامل المسبب لآفة أوراق أنثراكنوز وتعفن الساق ، و Stenocarpella maydis ، الذي يسبب لفحة أوراق الديبلوديا وتعفن الساق. ومع ذلك ، يجب أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على مسببات الأمراض الفطرية الورقية الأخرى والنخرية. تتشابه الاستجابات الخلوية والفسيولوجية أثناء أحداث العدوى والاستعمار في أغماد الأوراق المستأصلة هذه مع تلك الموجودة في شفرات الأوراق بأكملها12،14،15. علاوة على ذلك ، فإن الاستعمار النصفي لخلايا البشرة الغمد بواسطة C. graminicola يشبه استعمار خلايا لب الساق16,17. تظهر الأغماد المنفصلة تزامنا أكبر واستنساخا تجريبيا لاختراق الفطريات واستعمارها مقارنة بشفرات الأوراق أو أنسجة لب الساق14،16،17،18. يمكن استخدام معظم أصناف الذرة لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن السلالات الداخلية أو الهجينة ذات الأصباغ الأرجوانية المفرطة في الأغماد أقل ملاءمة لأن الأصباغ تتداخل مع التصوير. كانت الذرة الحلوة في اليوبيل الذهبي مفيدة بشكل خاص لدراساتنا لأن البذور غير المعالجة متوفرة تجاريا ، والنباتات معرضة بشدة للعديد من الأمراض الورقية ، وتنمو جيدا في الدفيئة. أدت الأوبئة الأولى لتعفن ساق أنثراكنوز في الولايات المتحدة إلى فقدان إجمالي لمحاصيل الذرة الحلوة في ولاية إنديانا في سبعينيات القرن العشرين19,20. يمكن تطبيق طريقة تلقيح غمد الأوراق هذه لمراقبة نمو الفطريات وتطورها بشكل مباشر وقياسها في الخلايا النباتية الحية مقابل الخلايا النباتية المقتولة محليا ، لإظهار تفاعلات المقاومة في الاستجابات المتوافقة / غير المتوافقة للعدوى الفطرية ، واختبار التفاعلات بين السلالات الفطرية على نفس الغمد في الوقت الفعلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تعديل طريقة تلقيح غمد الأوراق المحسنة الموصوفة هنا من بروتوكول أصلي تم تطويره وتم تطبيقه على أغلفة أوراق الأرز6،8،36. يسمح بملاحظات مباشرة ومفصلة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية إما بالمجهر واسع المجال أو متحد البؤر. ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون USDA-NIFA على دعمهم المالي (أرقام المنح 2018-67013-28489 و 2020-70410-32901). أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات معبر عنها في هذه المخطوطة هي آراء المؤلفين فقط ولا تعكس بالضرورة آراء وزارة الزراعة الأمريكية. نشكر الطالبة الزائرة من البرازيل ، ميارا دي سيلفا ، على الصور التي تظهر في الشكل 6A وفي الشكل 7D. كما نعترف بقسم أمراض النبات في جامعة كنتاكي لتوفير الوصول إلى مجاهر أوليمبوس متحدة البؤر.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
