Frittliggende maiskjeder for levende celleavbildning av infeksjon av soppbladmaispatogener
Summary
Dette manuskriptet beskriver en optimalisert inokulasjonsprotokoll som bruker frittliggende maisbladskjeder for reproduserbare cytologiske, fysiologiske og molekylære studier av maisinteraksjoner med soppplantepatogener. Bladkappene letter sanntidsobservasjon av cellulære interaksjoner mellom levende plante og sopp i ufikserte vev.
Abstract
Vi har optimalisert en protokoll for å inokulere maisbladskjede med hemibiotrofiske og nekrotrofe bladpatogene sopp. Metoden er modifisert fra en som opprinnelig ble brukt på risbladskjeder og tillater direkte mikroskopisk observasjon av soppvekst og utvikling i levende planteceller. Bladskjede samlet fra maisplanter med to fullt oppståtte bladkrager inokuleres med 20 μL dråper på 5 x 105 sporer/ml soppsporesuspensjoner og inkuberes i fuktighetskamre ved 23 °C under kontinuerlig fluorescerende lys. Etter 24-72 timer fjernes overflødig vev med et barberblad for å etterlate et enkelt lag epidermale celler, en optisk klar prøve som kan avbildes direkte uten at det er nødvendig med kjemisk fiksering eller rydding. Plante- og soppceller forblir i live i løpet av forsøket, og interaksjoner kan visualiseres i sanntid. Skjeder kan farges eller underkastes plasmolyse for å studere utviklingscytologi og levedyktighet av verts- og patogenceller under infeksjon og kolonisering. Svampestammer transformert til å uttrykke fluorescerende proteiner kan inokuleres eller co-inokuleres på kappene for økt oppløsning og for å lette evalueringen av konkurrerende eller synergistiske interaksjoner. Svampestammer som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner kan brukes til å spore og kvantifisere produksjonen og målrettingen av disse individuelle proteinene i planta. Inokulert skjede vev kan ekstraheres for å karakterisere nukleinsyrer, proteiner eller metabolitter. Bruken av disse kappeanalysene har i stor grad avansert de detaljerte studiene av mekanismene for sopppatogenitet i mais og også av soppproteineffektorer og sekundære metabolitter som bidrar til patogenitet.
Introduction
Romlige og tidsmessige analyser på cellenivå er avgjørende for å forstå fysiologien og cytologien til sopp-plante-interaksjoner. Bladvev som har blitt kjemisk fiksert 1,2,3 eller ryddet og farget4, samt kunstige membraner5, har tidligere blitt brukt til å undersøke cytologien av bladpatogenutvikling og plante-soppinteraksjoner. Imidlertid er undersøkelse av infeksjonshendelser i levende vertsvev i sanntid uten fiksering eller clearing utfordrende på grunn av tekniske problemer knyttet til fremstilling av optisk gjennomsiktige prøver for avbildning.
En frittliggende bladkappeinokulasjonsprotokoll ble utviklet på slutten av 1940-tallet for lysfeltmikroskopisk undersøkelse av resistens fra levende risepidermale celler mot risblastsvampen Magnaporthe oryza6. Mer nylig har detaljerte molekylære, fysiologiske og cytologiske observasjoner av vertskolonisering av Colletotrichum og Magnaporthe-artene blitt sterkt tilrettelagt ved å kombinere modifiserte versjoner av denne bladkappemetoden med sopptransformanter som uttrykker fluorescerende proteiner, og høyytelses levende celleavbildningsprotokoller, inkludert epifluorescens og konfokal mikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Dette papiret beskriver en optimalisert inokulasjonsprotokoll ved bruk av frittliggende maisbladskjeder for observasjon av infeksjonsprosesser av hemibiotrofiske og nekrotrofiske bladsvamppatogener. Vi har spesielt brukt den til å studere Colletotrichum graminicola (C. graminicola), årsaksmidlet til antracnosebladblight og stengelråte, og Stenocarpella maydis, som forårsaker Diplodia bladblight og stengelråte. Metoden bør imidlertid kunne anvendes på andre hemibiotrofiske og nekrotrofe bladsvamppatogener. Cytologiske og fysiologiske responser under infeksjons- og koloniseringshendelser i disse utskårne bladkappene ligner de i hele bladbladene12,14,15. Videre er hemibiotrofisk kolonisering av skjede epidermale celler av C. graminicola lik kolonisering av stengelceller16,17. Frittliggende skjeder viser større synkronitet og eksperimentell reproduserbarhet av sopppenetrasjon og kolonisering enn bladblad eller stengelvev14,16,17,18. De fleste maisvarianter kan brukes til denne protokollen. Imidlertid er innavlede eller hybrider med overdreven lilla pigmenter i mantlene mindre egnet siden pigmentene forstyrrer avbildning. Golden Jubilee søt mais har vært spesielt nyttig for våre studier fordi ubehandlede frø er kommersielt tilgjengelige, plantene er svært utsatt for mange bladsykdommer, og de vokser godt i drivhuset. De første epidemiene av antracnose stengelråte i USA resulterte i totalt tap av søte maisavlinger i Indiana på1970-tallet 19,20. Denne bladkappeinokulasjonsmetoden kan brukes til direkte å observere og kvantifisere soppvekst og utvikling i levende vs. lokalt drepte planteceller, for å demonstrere resistensreaksjoner i kompatible / inkompatible responser på soppinfeksjon, og for å teste interaksjoner mellom soppstammer på samme skjede i sanntid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimaliserte inokulasjonsmetoden for bladkappe beskrevet her er modifisert fra en original protokoll som ble utviklet for og har blitt brukt på risbladskjeder 6,8,36. Det tillater direkte, detaljerte observasjoner av soppvekst og utvikling i levende planteceller med enten bredfelts- eller konfokalmikroskopi. Protokollen er egnet for karakterisering, sammenligning og kvantifisering av en rekke mikroskopiske fenomener under …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker USDA-NIFA for deres økonomiske støtte (tilskuddsnummer 2018-67013-28489 og 2020-70410-32901). Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette manuskriptet er utelukkende forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til det amerikanske landbruksdepartementet. Vi takker besøkende student fra Brasil, Mayara de Silva, for bildene som vises i figur 6A og i figur 7D. Vi anerkjenner også Institutt for plantepatologi ved University of Kentucky for å gi tilgang til Olympus konfokale mikroskoper.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
