Dette arbejde præsenterer et alternativt flatmount retina-præparat, hvor fjernelse af fotoreceptorcellelegemer muliggør hurtigere antistofdiffusion og forbedret patchpipetteadgang til indre retinale neuroner til immunhistokemi, in situ-hybridisering og elektrofysiologiske eksperimenter.
Bipolære celler og vandrette celler i hvirveldyrets nethinden er de første neuroner, der behandler visuel information, efter at fotoner er detekteret af fotoreceptorer. De udfører grundlæggende operationer som lystilpasning, kontrastfølsomhed og rumlig og farvemodsætning. En fuldstændig forståelse af de præcise kredsløb og biokemiske mekanismer, der styrer deres adfærd, vil fremme visuel neurovidenskabelig forskning og oftalmologisk medicin. Imidlertid er de nuværende præparater til undersøgelse af bipolære og vandrette celler (retinale hele monteringer og lodrette skiver) begrænset i deres evne til at fange disse cellers anatomi og fysiologi. I dette arbejde præsenterer vi en metode til fjernelse af fotoreceptorcellelegemer fra levende, flatmount musenethinder, hvilket giver forbedret adgang til bipolære og vandrette celler for effektiv patch clamping og hurtig immunmærkning. Opdelte nethinden fremstilles ved at sandwiche en isoleret musenethinden mellem to stykker nitrocellulose og derefter forsigtigt skrælle dem fra hinanden. Adskillelsen deler nethinden lige over det ydre plexiforme lag for at give to stykker nitrocellulose, en indeholdende fotoreceptorcellelegemerne og en anden indeholdende den resterende indre nethinden. I modsætning til lodrette nethindeskiver afbryder det delte nethindepræparat ikke de dendritiske processer i indre retinale neuroner, hvilket giver mulighed for optagelser fra bipolære og vandrette celler, der integrerer bidragene fra gap junction-koblede netværk og wide-field amakrin celler. Dette arbejde demonstrerer alsidigheden af dette præparat til undersøgelse af vandrette og bipolære celler i elektrofysiologi, immunohistokemi og in situ hybridiseringseksperimenter.
Nethinden er et tyndt neuralt væv placeret i det bageste øje, hvor lys opfanges og behandles til et elektrokemisk signal, der kan fortolkes af hjernen. På bagsiden af nethinden stimuleres stang- og keglefotoreceptorer af lys, hvilket reducerer den toniske frigivelseshastighed for neurotransmitteren, glutamat1. De første neuroner, der oplever og reagerer på denne lysinducerede ændring i glutamatkoncentrationen, er de bipolære celler (BC’er) og vandrette celler (HC’er), hvis somas befinder sig i den yderste region af det indre nukleare lag (INL). Disse andenordens neuroner udfører den første fase af signalbehandling i nethinden og former kritiske træk ved synet, såsom lystilpasning, kontrastfølsomhed og rumlig / farvemodstand2. Mens disse funktioner er blevet tilskrevet BC’er og HC’er, er kredsløbene og de biokemiske mekanismer, der ligger til grund for disse processer, ikke fuldt ud forstået3. Derfor er udviklingen af værktøjer og metoder til at udforske BC og HC fysiologi af afgørende betydning.
Lodrette (tværgående) nethindesektioner har længe vist sig at være den mest praktiske model til at studere BC’er og HC’er; visse aspekter af BC- og HC-fysiologi er imidlertid utilgængelige for eksperimentatoren under denne model. Direkte optagelser fra HC’er eller indirekte målinger af deres virkninger på BC’er afspejler ikke nethindens endogene forbindelse, da disse cellers laterale processer afbrydes under udskæring. Hele monterede nethindepræparater omgår dette problem ved at bevare disse laterale processer, men de omgivende retinale lag udgør en udfordring for at få adgang til disse celler4. Mens der er rigelige eksempler på immunfarvning 5,6,7,8 og patch clamp optagelser9 fra INL neuroner i hele mount nethinder, er der mulighed for at fremskynde og forenkle indsamlingen af disse data. De iboende begrænsninger ved tværgående sektioner og udfordringerne ved hele monteringsmodellen inspirerede således udviklingen af dette alternative flatmount nethindepræparat.
Følgende arbejde beskriver en protokol til let fjernelse af fotoreceptorlaget fra levende, fladmonterede nethinden for at forbedre adgangen til BC’er og HC’er for forenklet patchfastspænding og hurtigere og mere effektiv immunmærkning. Skrælning fra hinanden to stykker nitrocellulosemembran fastgjort til hver side af en isoleret nethinden river vævet gennem fotoreceptoraxonerne og efterlader en delt nethinden, der bevarer det ydre plexiformlag (OPL) og alle indre retinale lag. Mens andre har beskrevet protokoller til mekanisk adskillelse af lag af nethinden, er disse metoder enten dårligt egnede til patch clamping og mikroskopi applikationer eller kræver kedelig manipulation af vævet. Flere af disse metoder kræver frosset eller frysetørret væv til lagadskillelse, hvilket gør dem uforenelige med elektrofysiologiske eksperimenter10,11,12. Andre er designet til levende væv, men kræver 5-15 sekventielle peelinger med filterpapir 4,11 eller behandling med trypsin 13 for at fjerne fotoreceptorerne. Den teknik, der beskrives her, forbedrer sine forgængere ved at forenkle proceduren for fjernelse af fotoreceptorer og udvide repertoiret af downstream-applikationer.
Efter fotoreceptorer transducerer fotonabsorption til neurotransmitterfrigivelse, er BC’er og HC’er de første retinale neuroner, der behandler det visuelle signal23. Mens betydningen af disse neuroner er værdsat, er mange af deres funktioner ufuldstændigt forstået eller uudforsket helt. Mange BC- og HC-fysiologiske undersøgelser ville sandsynligvis drage fordel af et fladmonteret nethindepræparat, der forbedrer adgangen til INL-neuroner, samtidig med at lateral forbindelse bevares. Udviklingen af split retina-metoden repræsenterer et forsøg på at give en nem protokol til indsamling af elektrofysiologiske optagelser og mikroskopidata af høj kvalitet fra BC’er og HC’er i en flatmount orientering. Det delte nethindepræparat, der er beskrevet her, kan udføres på ca. 20 min pr. mus (10 min pr. nethinde) efter nethindeisolering uden brug af specialudstyr. Metoden henter inspiration fra eksisterende procedurer for fjernelse af fotoreceptorer, men tilbyder betydelige forbedringer i enkelhed, hastighed og alsidighed 4,10,11,12,13. I modsætning til tidligere metoder til adskillelse af retinale lag kræver retina-opdeling ikke frysning, frysetørring eller gentagen påføring af klæbemidler på nethinden. Med praksis kan næsten alle fotoreceptorer fjernes i en enkelt tåre med nitrocellulosemembranen. Hastigheden og letheden ved denne tilgang gør det muligt at minimere den tid, nethinden bruger ud af carbogenated Ames, hvilket muliggør høj cellelevedygtighed i lange perioder; splittede nethinden kan opretholdes i carbogenated Ames medier i flere timer efter split. Som et vidnesbyrd om INL-neuronernes sundhed i dette præparat bekræfter en levende / død celleplet (figur 4) og patch-clamp elektrofysiologi (figur 6) levedygtigheden af RBC’er og HC’er efter en split.
Fjernelsen af fotoreceptorlaget i splittede nethinden giver en betydelig fordel under immunmærkning ved dramatisk at reducere diffusionstiden for antistoffer i INL. Primær og sekundær antistofmærkning kan afsluttes inden for 2 timer, en væsentlig forbedring af konventionel flatmount-farvning, som kan tage 72 timer eller længere afhængigt af målet 5,6,7,8,20,22. Som et resultat kan mikroskopidata erhverves samme dag som vævspræparation, hvilket drastisk fremskynder tempoet i immunofluorescensforsøg. For at lette udglødning af mRNA-sonde anbefaler FISH-eksperimenter typisk meget længere fikseringstider (~ 24 timer) end immunmærkning18. De eksperimenter, der præsenteres her, viser imidlertid, at en 2 timers fiksering stadig producerer enestående FISH-mærkning (figur 5). På trods af at fikseringstiden blev forlænget fra 30 min til 2 timer, var det ikke nødvendigt at udføre antigenhentningstrin for at opnå fremragende immunmærkning, men dette kan variere med antistoffet eller antigenet. Proteasebehandlingen i FISH-protokollen kan forstyrre antistofmærkning, sandsynligvis på grund af ødelæggelsen af målepitoper. Dette problem blev omgået ved at bruge polyklonale antistoffer, der er målrettet mod flere epitoper, hvilket reducerer sandsynligheden for, at epitopdestruktion ville hindre immunmærkning. Derudover blev en moderat proteasebehandling (ACD protease III) brugt til at forhindre overdreven epitopændring, mens den stadig gav tilstrækkelig vævspenetration.
Lejlighedsvis vil nethinden i stedet splitte gennem det ydre nukleare lag (ONL) og efterlade lag af fotoreceptorsomas uden synlige INL-celler. For at forhindre dette bør man sikre sig, at nethinden ligger helt fladt på glasset, og at eventuel resterende væske fra omkring nethinden er fjernet. At trykke mere fast på nitrocellulosen med penslen kan også hjælpe med at forhindre opdeling gennem ONL. Hvis membranen bliver for våd, eller nethinden foldes over sig selv, vil chancerne for en vellykket opdeling blive stærkt reduceret. Brug af DAPI til at plette cellekerner er nyttig til vurdering af kvaliteten af opdelingen og til bestemmelse af dækningen af resterende fotoreceptorer. Fotoreceptorkerner er mindre, lysere og mere overfladiske (supplerende figur 3A), mens BC-kerner er større, svagere og dybere (supplerende figur 3B). I nogle tilfælde vil tåreplanet variere lidt over nethinden, hvilket resulterer i pletter, hvor fotoreceptorer cellelegemer ikke er blevet fjernet fuldstændigt (supplerende figur 3C). For anvendelser inden for mikroskopi og elektrofysiologi hindrer dette ikke muligheden for at indsamle kvalitetsdata fra regioner, hvor fotoreceptorer er blevet fjernet korrekt; Store felter af eksponeret indre nethinden kan let findes ved billeddannelse eller optagelse med en plasterpipette. Hvis der ønskes mere fuldstændig fjernelse af fotoreceptorer, kan en anden tåre udføres med et ekstra stykke nitrocellulosemembran, selvom 100% fotoreceptorfjernelse ikke garanteres. Forsigtighed tilrådes derfor, når der anvendes splittede nethinden i genekspression eller proteomiske undersøgelser, hvor resterende fotoreceptormateriale kan påvirke resultaterne. For enkeltcelleapplikationer er denne bekymring uberettiget, da data fra fotoreceptorer kan udelukkes fra analyse.
Fordelene ved split retina præparatet er måske mest fremtrædende i elektrofysiologiske optagelser af wide-field interneuroner. Mens traditionelle lodrette skiver adskiller de omfattende processer i vidvinkelceller, efterlader det delte nethindepræparat OPL og IPL intakt, så man kan fange input fra vidvinkelceller som HC’er 24, A17s 25, TH AC’er26 og NOS-1 AC’er27, der ellers ville blive overset i lodrette skiver. Derfor kræver fortolkning af resultater og sammenligning med tidligere data indsamlet fra retinale skiver omhyggelig overvejelse. Ikke desto mindre ligner disse resultater i eksperimenter, der bruger farmakologiske efterligninger af lysstimulering, data registreret fra retinale skiver19. Ved at udtrykke ChR2 under cellespecifikke promotorer kan man stimulere en ønsket cellepopulation, mens man optager fra BC’er i INL for at undersøge den ønskede celles indvirkning på den vertikale informationsvej. Optagelse direkte fra dybere INL-neuroner, såsom amakrinceller, er også mulig i den delte nethinden. Mens plasterelektroden i dette tilfælde først skal rejse gennem de mere overfladiske INL-neuroner, er der betydeligt mindre væv, der forhindrer dens vej sammenlignet med et traditionelt helmonteret præparat.
Ud over at måle indflydelsen af vidvinkelceller på andre neuroner muliggør denne metode direkte enkeltcelleplasterfastspænding fra HC’er, hvis dendritter danner et omfattende gap-junction-koblet netværk i OPL28. Vandrette celler sender kritisk feedback til fotoreceptorer, som former transmissionen af lodret information gennem nethinden. Men da de dendritiske felter af HC’er afkortes i lodrette skiver, mangler enkeltcelleoptagelsesdata. Dette arbejde præsenterer anatomisk og fysiologisk intakte HC’er, hvorfra ChR2-fremkaldte strømme registreres i en tredobbelt transgen muselinje (figur 6 C-E). Uden for ChR2-stimulering kan den delte nethinden bruges til at studere endogene HC-strømme og gap junctioncoupling 28. Mens den delte nethinden giver en bekvem model til at studere synaptisk forbindelse og neuronal aktivitet induceret af kemisk applikation eller ChR2-stimulering, udelukker manglen på fotoreceptorer enhver direkte udforskning af naturlige lysresponser eller lystilpasningsmekanismer.
In situ billeddannelse i nethinden har gjort beundringsværdige fremskridt i de senere år. Imidlertid er størstedelen af billeddannelsesundersøgelser begrænset til ganglioncellelaget i helmonterede nethindepræparater29. Forfatterne forestiller sig, at fraværet af fotoreceptorer i den delte nethinden vil gøre det til en ideel model for levende calciumbilleddannelse i OPL og INL. Ud over calciumbilleddannelse har denne model et stort potentiale til brug med genetisk kodede biosensorer såsom iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 og pHluorin33. Kombineret med split retina præparatet kan disse kraftfulde værktøjer tilbyde en effektiv tilgang til at udforske de synaptiske interaktioner og biofysiske egenskaber hos BC’er og HC’er, der bidrager til lysbehandling i nethinden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af følgende NIH-tilskud: NIH-tilskud R01EY031596 (til C.M.); NIH-tilskud R01EY029985 (til C.M.); NIH-tilskud P30EY010572 (til C.M.); NIH-tilskud R01EY032564 (til BS). Vi takker Tammie Haley for hendes tekniske støtte til forberedelse af nethindesektioner og Dr. Charles Allen for generøst at bidrage med mRNA FISH-sonder, der bruges i dette arbejde.
#1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |