Dette arbeidet presenterer et alternativt flatmount retinapreparat der fjerning av fotoreceptorcellelegemer muliggjør raskere antistoffdiffusjon og forbedret patchpipettetilgang til indre retinale nevroner for immunhistokjemi, in situ hybridisering og elektrofysiologieksperimenter.
Bipolare celler og horisontale celler i vertebrate retina er de første nevronene som behandler visuell informasjon etter at fotoner er detektert av fotoreceptorer. De utfører grunnleggende operasjoner som lystilpasning, kontrastfølsomhet og romlig og fargeopponens. En fullstendig forståelse av de nøyaktige kretsene og biokjemiske mekanismene som styrer deres oppførsel, vil fremme visuell nevrovitenskapsforskning og oftalmologisk medisin. Imidlertid er nåværende preparater for å undersøke bipolare og horisontale celler (retinale hele fester og vertikale skiver) begrenset i deres evne til å fange anatomien og fysiologien til disse cellene. I dette arbeidet presenterer vi en metode for å fjerne fotoreceptorcellelegemer fra levende, flatmonterte musenetthinner, noe som gir forbedret tilgang til bipolare og horisontale celler for effektiv patchklemming og rask immunmerking. Split retinas er tilberedt ved å smøre en isolert mus retina mellom to stykker nitrocellulose, og deretter forsiktig peeling dem fra hverandre. Separasjonen splitter netthinnen like over det ytre pleksiforme laget for å gi to stykker nitrocellulose, en som inneholder fotoreceptorcellelegemene og en annen som inneholder gjenværende indre retina. I motsetning til vertikale retina-skiver, kutter det delte retinapreparatet ikke de dendritiske prosessene i indre retinale nevroner, noe som muliggjør opptak fra bipolare og horisontale celler som integrerer bidragene fra gapkrysskoblede nettverk og bredfeltamakrinceller. Dette arbeidet demonstrerer allsidigheten til dette preparatet for studier av horisontale og bipolare celler i elektrofysiologi, immunhistokjemi og in situ hybridiseringseksperimenter.
Netthinnen er et tynt nevralt vev som ligger i det bakre øyet hvor lys fanges opp og behandles til et elektrokjemisk signal som kan tolkes av hjernen. På baksiden av netthinnen stimuleres stang- og keglefotoreceptorer av lys, noe som reduserer tonisk frigjøringshastighet for nevrotransmitteren, glutamat1. De første nevronene som opplever og reagerer på denne lysinduserte endringen i glutamatkonsentrasjon er bipolare celler (BC) og horisontale celler (HCs), hvis somas bor i den ytre regionen av det indre kjernefysiske laget (INL). Disse andreordens nevronene utfører den første fasen av signalbehandling i netthinnen og former kritiske synsfunksjoner som lystilpasning, kontrastfølsomhet og romlig / fargeopponens2. Selv om disse funksjonene har blitt tilskrevet BC og HC, er kretsene og biokjemiske mekanismene som ligger til grunn for disse prosessene ikke fullt ut forstått3. Derfor er utviklingen av verktøy og metoder for å utforske BC- og HC-fysiologi av avgjørende betydning.
Vertikale (tverrgående) retinaseksjoner har lenge vist seg å være den mest praktiske modellen for å studere BC og HCs; Imidlertid er visse aspekter av BC- og HC-fysiologi utilgjengelige for eksperimentøren under denne modellen. Direkte opptak fra HCer eller indirekte målinger av deres effekter på BC gjenspeiler ikke retinas endogene tilkobling, siden de laterale prosessene til disse cellene blir kuttet under kutting. Hele mount retina preparater omgå dette problemet ved å bevare disse laterale prosesser, men de omkringliggende retinal lagene utgjør en utfordring for å få tilgang til disse cellene4. Mens det er rikelig eksempler på immunostaining 5,6,7,8 og patch clamp recordings9 fra INL-nevroner i hele mount retinas, er det en mulighet til å fremskynde og forenkle innsamlingen av disse dataene. De iboende begrensningene i tverrsnitt og utfordringene med hele monteringsmodellen inspirerte dermed utviklingen av dette alternative flatmount retinapreparatet.
Følgende arbeid beskriver en protokoll for enkelt å fjerne fotoreceptorlaget fra levende, flatmonterte retinaer for å forbedre tilgangen til BC og HC for forenklet patchklemming og raskere, mer effektiv immunmerking. Peeling fra hverandre to stykker nitrocellulosemembran festet til hver side av en isolert retina tårer vevet gjennom fotoreceptoraksonene, og etterlater en splittet retina som beholder det ytre pleksiforme laget (OPL) og alle indre retinale lag. Mens andre har beskrevet protokoller for mekanisk separering av lag av netthinnen, er disse metodene enten dårlig egnet til patchklemming og mikroskopiapplikasjoner eller krever kjedelig manipulering av vevet. Flere av disse metodene krever frosset eller lyofilisert vev for lagseparasjon, noe som gjør dem uforenlige med elektrofysiologiske eksperimenter10,11,12. Andre er designet for levende vev, men krever 5-15 sekvensielle peelinger med filterpapir 4,11 eller behandling med trypsin 13 for å fjerne fotoreseptorene. Teknikken beskrevet her forbedrer sine forgjengere ved å forenkle prosedyren for fjerning av fotoreseptorer og utvide repertoaret til nedstrømsapplikasjoner.
Etter at fotoreceptorer transducerer fotonabsorpsjon i nevrotransmitterfrigivelse, er BC og HCs de første retinale nevronene som behandler det visuelle signalet23. Mens betydningen av disse nevronene er godt verdsatt, er mange av deres funksjoner ufullstendig forstått eller uutforsket helt. Mange BC- og HC-fysiologistudier vil sannsynligvis ha nytte av et flatmontert retinapreparat som forbedrer tilgangen til INL-nevroner samtidig som lateral tilkobling opprettholdes. Utviklingen av split retina-metoden representerer et forsøk på å gi en enkel protokoll for å anskaffe elektrofysiologiske opptak av høy kvalitet og mikroskopidata fra BC og HC i en flatmontert retning. Det delte netthinnepreparatet beskrevet her kan utføres på ca. 20 minutter per mus (10 minutter per netthinne) etter netthinneisolasjon, uten bruk av spesialutstyr. Metoden henter inspirasjon fra eksisterende prosedyrer for fjerning av fotoreseptorer, men gir betydelige forbedringer i enkelhet, hastighet og allsidighet 4,10,11,12,13. I motsetning til tidligere metoder for å separere retinale lag, krever retina splitting ikke frysing, lyofilisering eller gjentatt påføring av lim på netthinnen. Med praksis kan nesten alle fotoreceptorer fjernes i en enkelt tåre med nitrocellulosemembranen. Hastigheten og enkelheten i denne tilnærmingen gjør at man kan minimere tiden netthinnen bruker ut av karbogenerte Ames, noe som muliggjør høy celle levedyktighet i lange perioder; delte netthinner kan opprettholdes i karbogenerte Ames-medier i flere timer etter splittelse. Som et bevis på helsen til INL-nevroner i dette preparatet, bekrefter en levende / død celleflekk (figur 4) og patch-klemme elektrofysiologi (figur 6) levedyktigheten til RBC og HC etter en splittelse.
Fjernelsen av fotoreseptorlaget i delte netthinner gir en betydelig fordel under immunmerking ved dramatisk å redusere diffusjonstiden for antistoffer i INL. Primær og sekundær antistoffmerking kan fullføres innen 2 timer, en betydelig forbedring av konvensjonell flatmount farging som kan ta 72 timer eller lenger, avhengig av målet 5,6,7,8,20,22. Som et resultat kan mikroskopidata oppnås samme dag som vevpreparasjon, noe som drastisk akselererer tempoet i immunfluorescenseksperimenter. For å lette glødning av mRNA-sonder, anbefaler FISH-eksperimenter vanligvis mye lengre fikseringstider (~24 timer) enn immunmerking18. Forsøkene som presenteres her viser imidlertid at en 2 timers fiksering fortsatt gir eksepsjonell FISH-merking (figur 5). Til tross for at fiksasjonstiden ble forlenget fra 30 min til 2 timer, var det ikke nødvendig å utføre antigenuthentingstrinn for å oppnå utmerket immunmerking, men dette kan variere med antistoffet eller antigenet. Proteasebehandlingen i FISH-protokollen kan forstyrre antistoffmerkingen, sannsynligvis på grunn av destruksjon av målepitoper. Dette problemet ble omgått ved å bruke polyklonale antistoffer som retter seg mot flere epitoper, noe som reduserer sannsynligheten for at epitopdestruksjon vil hindre immunmerking. I tillegg ble en moderat proteasebehandling (ACD protease III) brukt for å forhindre overdreven epitopforandring samtidig som det ga tilstrekkelig vevspenetrasjon.
Av og til vil netthinnen i stedet splittes gjennom det ytre kjernefysiske laget (ONL), og etterlate lag av fotoreceptor somas uten INL-celler synlige. For å unngå dette bør man sørge for at netthinnen ligger helt flatt på glasset, og at eventuell restvæske fra rundt netthinnen er fjernet. Å trykke fastere på nitrocellulosen med penselen kan også bidra til å forhindre splitting gjennom ONL. Hvis membranen blir for våt eller netthinnen brettes over seg selv, vil sjansene for en vellykket splittelse bli sterkt redusert. Bruk av DAPI for å farge cellekjerner er nyttig for å vurdere kvaliteten på splittelsen og for å bestemme dekningen av gjenværende fotoreceptorer. Fotoreseptorkjerner er mindre, lysere og mer overfladiske (tilleggsfigur 3A), mens BC-kjerner er større, dimmere og dypere (tilleggsfigur 3B). I noen tilfeller vil riftens plan variere litt over netthinnen, noe som resulterer i flekker der fotoreseptorens cellelegemer ikke er helt fjernet (tilleggsfigur 3C). For applikasjoner innen mikroskopi og elektrofysiologi hindrer dette ikke muligheten til å samle kvalitetsdata fra regioner der fotoreceptorer er fjernet på riktig måte; Store felt av eksponert indre netthinne kan lett bli funnet ved avbildning eller opptak med en patchpipette. Hvis mer fullstendig fotoreceptorfjerning er ønsket, kan en ny rift utføres med et ekstra stykke nitrocellulosemembran, selv om 100% fjerning av fotoreceptor ikke er garantert. Forsiktighet anbefales derfor ved bruk av delte netthinner i genuttrykks- eller proteomikkstudier der gjenværende fotoreseptormateriale kan påvirke resultatene. For enkeltcelleapplikasjoner er denne bekymringen uberettiget, da data fra fotoreceptorer kan utelukkes fra analyse.
Fordelene ved det delte netthinnepreparatet er kanskje mest fremtredende i elektrofysiologiske registreringer av bredfeltinternevroner. Mens tradisjonelle vertikale skiver kutter de omfattende prosessene med bredfeltceller, forlater det delte retinapreparatet OPL og IPL intakt, slik at man kan fange inngang fra bredfeltceller som HCs 24, A17s25, TH ACs 26 og NOS-1 ACs27 som ellers ville bli oversett i vertikale skiver. Derfor krever tolkning av resultater og sammenligning med tidligere data samlet inn fra retinale skiver nøye gjennomtenkt. Likevel, i eksperimenter med farmakologiske etterligninger av lysstimulering, ligner disse resultatene data registrert fra retinalskiver19. Ved å uttrykke ChR2 under cellespesifikke promotorer, kan man stimulere en ønsket cellepopulasjon mens man registrerer fra BCs i INL for å undersøke ønsket celles innvirkning på den vertikale informasjonsveien. Opptak direkte fra dypere INL-nevroner, som amakrine celler, er også mulig i den delte netthinnen. Mens patchelektroden i dette tilfellet først må bevege seg gjennom de mer overfladiske INL-nevronene, er det betydelig mindre vev som hindrer banen sammenlignet med et tradisjonelt helmonteringspreparat.
I tillegg til å måle påvirkning av bredfeltceller på andre nevroner, muliggjør denne metoden direkte enkeltcellepatchklemming fra HC, hvis dendritter danner et omfattende gap-junction-koblet nettverk i OPL28. Horisontale celler sender kritisk tilbakemelding til fotoreceptorer som former overføringen av vertikal informasjon gjennom netthinnen. Men siden de dendritiske feltene til HCer er avkortet i vertikale skiver, mangler enkeltcelleopptaksdata. Dette arbeidet presenterer anatomisk og fysiologisk intakte HCer hvorfra ChR2-fremkalte strømmer registreres i en trippel transgen muselinje (figur 6 C-E). Utenfor ChR2-stimulering kan den delte netthinnen brukes til å studere endogene HC-strømmer og gapkrysskobling28. Mens den delte netthinnen gir en praktisk modell for å studere synaptisk tilkobling og nevronaktivitet indusert ved kjemisk applikasjon eller ChR2-stimulering, utelukker mangelen på fotoreceptorer direkte utforskning av naturlige lysresponser eller lystilpasningsmekanismer.
In situ avbildning i netthinnen har gjort beundringsverdig fremgang de siste årene. Imidlertid er flertallet av bildebehandlingsstudier begrenset til ganglioncellelaget i hele mount retina-preparater29. Forfatterne ser for seg at fraværet av fotoreceptorer i delt retina vil gjøre det til en ideell modell for levende kalsiumavbildning i OPL og INL. Utover kalsiumavbildning har denne modellen stort potensial for bruk med genetisk kodede biosensorer som iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 og pHluorin33. Kombinert med det delte retinapreparatet, kan disse kraftige verktøyene tilby en effektiv tilnærming til å utforske synaptiske interaksjoner og biofysiske egenskaper av BC og HCer som bidrar til lysbehandling i netthinnen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av følgende NIH-stipender: NIH-stipend R01EY031596 (til C.M.); NIH-stipend R01EY029985 (til C.M.); NIH-stipend P30EY010572 (til C.M.); NIH stipend R01EY032564 (til BS). Vi takker Tammie Haley for hennes tekniske støtte i forberedelsen av netthinneseksjoner, og Dr. Charles Allen for sjenerøst å bidra med mRNA FISH-sondene som brukes i dette arbeidet.
#1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |