Sporing af miRNA-frigivelse i ekstracellulære vesikler ved hjælp af flowcytometri
Summary
Her beskriver vi en ligetil protokol, der muliggør in vitro-vurdering af overflod af fluorescerende mærkede mikroRNA’er for at studere dynamikken i mikroRNA-emballering og eksport til ekstracellulære vesikler (EV’er).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV’er) er vigtige mediatorer af cellulær kommunikation, der udskilles af en række forskellige celler. Disse EV’er transporterer bioaktive molekyler, herunder proteiner, lipider og nukleinsyrer (DNA, mRNA’er, mikroRNA’er og andre ikke-kodende RNA’er), fra en celle til en anden, hvilket fører til fænotypiske konsekvenser i modtagercellerne. Af alle de forskellige EV-laster har mikroRNA’er (miRNA’er) fået stor opmærksomhed for deres rolle i udformningen af mikromiljøet og i uddannelsen af modtagerceller på grund af deres klare dysregulering og overflod i EV’er. Yderligere data indikerer, at mange miRNA’er aktivt indlæses i elbiler. På trods af dette klare bevis er forskning i eksportdynamikken og mekanismerne for miRNA-sortering begrænset. Her leverer vi en protokol ved hjælp af flowcytometrianalyse af EV-miRNA, der kan bruges til at forstå dynamikken i EV-miRNA-belastning og identificere de maskiner, der er involveret i miRNA-eksport. I denne protokol konjugeres miRNA’er, der er forudbestemt til at blive beriget i EV’er og udtømt fra donorceller, til en fluorofor og transfekteres ind i donorcellerne. De fluorescerende mærkede miRNA’er verificeres derefter for indlæsning i EV’er og udtømning fra celler ved hjælp af qRT-PCR. Som både en transfektionskontrol og et værktøj til gating den transfekterede population af celler er et fluorescerende mærket cellulært RNA (celle-tilbageholdt og EV-udtømt) inkluderet. Celler transfekteret med både EV-miRNA og celle-tilbageholdt-miRNA evalueres for fluorescerende signaler i løbet af 72 timer. Fluorescenssignalintensiteten, der er specifik for EV-miRNA’erne, falder hurtigt sammenlignet med det celletilbageholdte miRNA. Ved hjælp af denne enkle protokol kunne man nu vurdere dynamikken i miRNA-belastning og identificere forskellige faktorer, der er ansvarlige for at indlæse miRNA’er i EV’er.
Introduction
MicroRNA’er (miRNA’er) er en af de bedst karakteriserede undergrupper af små ikke-kodende RNA’er, som er kendt for deres kritiske rolle i posttranskriptionel genregulering. Ekspressionen og biogenesen af de fleste miRNA’er følger en koordineret række begivenheder, der begynder med transkription af de primære miRNA’er (pri-miRNA’er) i kernen. Efter nuklear behandling af mikroprocessorkomplekset i precursor-miRNA’er (pre-miRNA’er) eksporteres pre-miRNA’erne til cytoplasmaet, hvor de gennemgår yderligere behandling af RNase III-endonukleasen, dicer i 21-23 nukleotidmodne miRNA-duplekser1. En af strengene i det forarbejdede modne miRNA binder til målbudbringer-RNA’er (mRNA’er), hvilket fører til nedbrydning eller translationel undertrykkelse af målene2. Baseret på miRNA’ernes pleiotropiske rolle i samtidig regulering af flere forskellige mål-mRNA’er er det ikke overraskende, at miRNA-ekspression er stramt reguleret3. Faktisk bidrager upassende udtryk til forskellige sygdomstilstande, især i kræft. Den afvigende ekspression af miRNA’er repræsenterer ikke kun en sygdomsspecifik signatur, men har også vist sig som et mål for prognostisk og terapeutisk potentiale 4,5,6. Ud over deres intracellulære roller har miRNA’er også ikke-autonome roller. For eksempel kan miRNA’er selektivt pakkes i EV’er af donorceller og eksporteres til modtagersteder, hvor de fremkalder forskellige fænotypiske reaktioner i normal- og sygdomsfysiologi 7,8,9.
På trods af klare beviser for, at EV-associerede miRNA’er er funktionelle biomolekyler, er det ikke helt forstået, hvordan specifikke undergrupper af miRNA’er er dysregulerede i sygdomstilstande som kræft, og hvordan cellulære maskiner vælger og sorterer miRNA’er i Evs10,11. I betragtning af EV-miRNA’ernes potentielle rolle i modulering af mikromiljøet er det afgørende at identificere de mekanismer, der er involveret i eksporten af udvalgte miRNA’er for fuldt ud at belyse EV’ernes rolle i intercellulær kommunikation og sygdomspatogenese. Forståelse af processen med miRNA-frigivelse i EV’er vil ikke kun fremhæve vigtige mediatorer af miRNA-eksport, men kan også give indsigt i potentielle behandlinger. For at opnå dette niveau af viden skal værktøjerne tilpasses til trofast at løse disse nye eksperimentelle spørgsmål. Faktisk vokser undersøgelser, der evaluerer elbiler, eksponentielt på grund af introduktionen af nye teknikker og kontroller12,13. I forhold til evaluering af overflod af eksporterede miRNA’er til EV’er har næste generations sekventering og kvantitativ revers transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR) været de nuværende standardværktøjer. Mens disse værktøjer er nyttige til evaluering af overflod af miRNA’er i elbiler, er der begrænsninger for deres følsomhed og specificitet, og det er ikke tilstrækkeligt at bruge disse statiske tilgange til evaluering af dynamik. At analysere dynamikken i miRNA-eksport til elbiler kræver en kombination af specialiserede værktøjer. Her præsenterer vi en omfattende protokol ved hjælp af fluorescerende konjugerede miRNA’er til at analysere dynamikken i miRNA-frigivelse fra donorceller og inkorporering i EV’er. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved metoden og giver anbefalinger til optimal brug. Den alsidige metode, der præsenteres i denne artikel, vil være nyttig for forskere, der er interesserede i at studere miRNA-frigivelse i elbiler og deres potentielle roller i cellulær kommunikation og sygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nyetablerede protokol gør det muligt at fange kinetik af miRNA-frigivelse i EV’er efter transfektion af EV-miRNA’er. Fremgangsmåden tillader samtidig analyse af flere EV-miRNA’er og celle-miRNA’er, underlagt cytometerets muligheder. Desuden, mens flowcytometrianalyse kan give værdifuld indsigt i EV miRNA-biologi, er det ikke uden begrænsninger. Omend nogle af begrænsningerne kan overvindes, når de bruges sammen med andre teknikker til en mere omfattende forståelse.
Et voksende inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender støtte og rådgivning fra Dr. Jill Hutchcroft, direktør for Flow Cytometry Core Facility ved Purdue University. Dette arbejde blev støttet af R01CA226259 og R01CA205420 til A.L.K., en American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 til A.L.K., et Purdue Shared resource facilitet tilskud P30CA023168 og et flagskib Fulbright Doctoral Scholarship tildelt af Department of the State, USA til H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
