Summary

Отслеживание высвобождения микроРНК во внеклеточные везикулы с помощью проточной цитометрии

Published: October 06, 2023
doi:

Summary

Здесь мы описываем простой протокол, который позволяет in vitro оценить обилие флуоресцентно меченных микроРНК для изучения динамики упаковки микроРНК и экспорта во внеклеточные везикулы (ВВ).

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) являются важными медиаторами клеточной коммуникации, которые секретируются различными клетками. Эти ВВ переносят биологически активные молекулы, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты (ДНК, мРНК, микроРНК и другие некодирующие РНК), из одной клетки в другую, что приводит к фенотипическим последствиям в клетках-реципиентах. МикроРНК (микроРНК) привлекли большое внимание из-за их роли в формировании микроокружения и в обучении клеток-реципиентов из-за их явной дисрегуляции и обилия в ВВ. Дополнительные данные указывают на то, что многие микроРНК активно загружаются в электромобили. Несмотря на эти четкие доказательства, исследования динамики экспорта и механизмов сортировки микроРНК ограничены. Здесь мы приводим протокол с использованием анализа EV-микроРНК методом проточной цитометрии, который может быть использован для понимания динамики загрузки EV-микроРНК и выявления механизмов, участвующих в экспорте микроРНК. В этом протоколе микроРНК, предварительно определенные для обогащения в ВВ и обедненные из донорских клеток, конъюгируются с флуорофором и трансфицируются в донорские клетки. Затем флуоресцентно меченные микроРНК проверяются на загрузку в ВВ и истощение клеток с помощью кОТ-ПЦР. В качестве средства контроля трансфекции и инструмента для стробирования трансфицированной популяции клеток используется флуоресцентно меченная клеточная РНК (с сохранением клеток и с истощением EV). Клетки, трансфицированные как EV-микроРНК, так и клеточной миРНК, оцениваются на флуоресцентные сигналы в течение 72 часов. Интенсивность флуоресцентного сигнала, специфичная для EV-микроРНК, быстро уменьшается по сравнению с клеточной микроРНК. Используя этот простой протокол, теперь можно оценить динамику загрузки микроРНК и определить различные факторы, ответственные за загрузку микроРНК в ВВ.

Introduction

МикроРНК (микроРНК) являются одним из наиболее хорошо охарактеризованных подмножеств малых некодирующих РНК, которые известны своей важнейшей ролью в посттранскрипционной регуляции генов. Экспрессия и биогенез большинства микроРНК следуют скоординированной серии событий, которые начинаются с транскрипции первичных микроРНК (при-миРНК) в ядре. После ядерной обработки микропроцессорным комплексом в микроРНК-предшественники (пре-микроРНК) пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму, где подвергаются дальнейшей обработке эндонуклеазой РНКазы III, разделенной на 21-23 нуклеотидные зрелые дуплексымикроРНК 1. Одна из цепей обработанной зрелой микроРНК связывается с матричными РНК-мишенями (мРНК), что приводит к деградации или трансляционному подавлению мишеней2. Основываясь на плейотропной роли микроРНК в одновременной регуляции нескольких различных мРНК-мишеней, неудивительно, что экспрессия микроРНКжестко регулируется. Действительно, неправильное выражение способствует возникновению различных болезненных состояний, особенно при раке. Аберрантная экспрессия микроРНК не только представляет собой специфическую для заболевания сигнатуру, но и стала мишенью для прогностического и терапевтического потенциала 4,5,6. В дополнение к своим внутриклеточным ролям, микроРНК также выполняют неавтономные функции. Например, микроРНК могут быть селективно упакованы в ВВ донорскими клетками и экспортированы в реципиенты, где они вызывают различные фенотипические реакции в норме и физиологии заболевания 7,8,9.

Несмотря на четкие доказательства того, что ВВ-ассоциированные микроРНК являются функциональными биомолекулами, до конца не ясно, как определенные подмножества микроРНК нарушают регуляцию при таких болезненных состояниях, как рак, и как клеточные механизмы отбирают и сортируют микроРНК в Evs 10,11. Учитывая потенциальную роль EV-микроРНК в модуляции микроокружения, крайне важно определить механизмы, участвующие в экспорте отдельных микроРНК, чтобы полностью прояснить роль EV в межклеточной коммуникации и патогенезе заболевания. Понимание процесса высвобождения микроРНК в ВВ не только выявит важные медиаторы экспорта микроРНК, но и может дать представление о потенциальных терапевтических средствах. Чтобы достичь такого уровня знаний, необходимо адаптировать инструменты для точного ответа на эти новые экспериментальные вопросы. Действительно, количество исследований, в которых оцениваются электромобили, растет в геометрической прогрессии из-за внедрения новых методов и средств контроля12,13. Что касается оценки обилия экспортируемых микроРНК в ВВ, то в настоящее время стандартными инструментами являются секвенирование нового поколения и количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР). Несмотря на то, что эти инструменты полезны для оценки количества микроРНК в ВВ, существуют ограничения на их чувствительность и специфичность, и использование этих статических подходов для оценки динамики недостаточно. Определение динамики экспорта микроРНК в ВВ требует комбинации специализированных инструментов. Здесь мы представляем комплексный протокол с использованием флуоресцентно конъюгированных микроРНК для анализа динамики высвобождения микроРНК из донорских клеток и встраивания в ВВ. Мы также обсудим преимущества и ограничения метода и дадим рекомендации по оптимальному использованию. Универсальный метод, представленный в этой статье, будет полезен исследователям, заинтересованным в изучении высвобождения микроРНК в ВВ и их потенциальной роли в клеточной коммуникации и заболеваниях.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве предварительного условия для использования этого метода требуется идентификация и валидация селективно экспортируемых микроРНК. Поскольку различные клеточные линии различаются в зависимости от груза микроРНК, отсортированного по их ВВ, рекомендуется, чтобы и?…

Representative Results

Здесь мы используем проточную цитометрию в качестве мощного инструмента для исследования высвобождения микроРНК из клеток в ВВ. С помощью этого протокола методом проточной цитометрии клеток, трансфицированных клеточными микроРНК и EV-микроРНК, выявлено последовательное снижение флу?…

Discussion

Новый протокол позволяет фиксировать кинетику высвобождения микроРНК в ВВ после трансфекции ВВ-микроРНК. Подход позволяет проводить одновременный анализ нескольких EV-микроРНК и клеточных микроРНК при условии использования возможностей цитометра. Более того, несмотря на то, что анал?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признательны за поддержку и советы д-ру Джилл Хатчкрофт (Jill Hutchcroft), директору центра проточной цитометрии в Университете Пердью. Эта работа была поддержана R01CA226259 и R01CA205420 для A.L.K., премией Американской ассоциации пульмонологов (ANALA2023) IA-1059916 для A.L.K., грантом Purdue Shared resource facility P30CA023168 и флагманской докторской стипендией Фулбрайта, присужденной Государственным департаментом, США Его Святейшеству.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher 05-408-129
15 mL Falcon tubes Corning 352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates Fisher Scientific FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)  Apogee Flow Systems 1527 To set up gating and parameters for particle detection 
Attune Nxt Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer BD Biosciences N/A For fluorescence analysis in cells 
Cell culture incubator N/A N/A Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium N/A N/A specific for the cell-line of interest
Cell line of interest  N/A N/A Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) Horizon discovery CP-004500-01-05 miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) Integrated DNA Technologies (IDT) miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs 
Fluorescence microscope N/A N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium Fisher Scientific 31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer Fisher 02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture) Fisher SH30256FS
Lipofectamine RNAimax Fisher Scientific 13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase Qiagen 339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR Qiagen  339347
mirVana RNA Isolation Qiagen AM1561
Nuclease free water Fisher Scientific 4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS Fisher AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile VWR 89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR ThermoFisher Scientific N/A
Trypsin 0.25% Fisher  SH3004201
Ultracentrifuge N/A N/A

References

  1. Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
  2. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
  3. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  4. Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
  5. Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
  6. Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
  7. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  8. Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
  9. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  10. Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
  11. Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
  12. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
  15. Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
  16. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  17. Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
  18. Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).

Play Video

Cite This Article
Hasan, H., Kasinski, A. L. Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (200), e65759, doi:10.3791/65759 (2023).

View Video