Spåra miRNA-frisättning i extracellulära vesiklar med hjälp av flödescytometri
Summary
Här beskriver vi ett enkelt protokoll som möjliggör in vitro-bedömning av förekomsten av fluorescerande märkta mikroRNA för att studera dynamiken i mikroRNA-förpackning och export till extracellulära vesiklar (EV).
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) är viktiga förmedlare av cellulär kommunikation som utsöndras av en mängd olika celler. Dessa EV transporterar bioaktiva molekyler, inklusive proteiner, lipider och nukleinsyror (DNA, mRNA, mikroRNA och andra icke-kodande RNA), från en cell till en annan, vilket leder till fenotypiska konsekvenser i mottagarcellerna. Av alla olika EV-laster har mikroRNA (miRNA) fått stor uppmärksamhet för sin roll i att forma mikromiljön och i att utbilda mottagarceller på grund av deras tydliga dysreglering och överflöd i EV. Ytterligare data tyder på att många miRNA aktivt laddas in i EV. Trots dessa tydliga bevis är forskningen om dynamiken i export och mekanismerna för miRNA-sortering begränsad. Här tillhandahåller vi ett protokoll med hjälp av flödescytometrianalys av EV-miRNA som kan användas för att förstå dynamiken i EV-miRNA-laddning och identifiera maskineriet som är involverat i miRNA-export. I detta protokoll konjugeras miRNA som är förutbestämda att anrikas i EV och utarmas från donatorceller till en fluorofor och transfekteras in i donatorcellerna. De fluorescerande märkta miRNA:erna verifieras sedan för laddning i EV och utarmning från celler med hjälp av qRT-PCR. Som både en transfektionskontroll och ett verktyg för att styra den transfekterade populationen av celler, ingår ett fluorescerande märkt cellulärt RNA (cellkvarhållet och EV-utarmat). Celler som transfekterats med både EV-miRNA och cell-retained-miRNA utvärderas för fluorescerande signaler under loppet av 72 timmar. Fluorescenssignalintensiteten som är specifik för EV-miRNA minskar snabbt jämfört med det cellkvarhållna miRNA:t. Med hjälp av detta enkla protokoll kunde man nu bedöma dynamiken i miRNA-laddningen och identifiera olika faktorer som är ansvariga för att ladda miRNA i EV.
Introduction
MikroRNA (miRNA) är en av de bäst karakteriserade undergrupperna av små icke-kodande RNA, som är kända för sin kritiska roll i post-transkriptionell genreglering. Uttrycket och biogenesen av de flesta miRNA följer en koordinerad serie händelser som börjar med transkription av de primära miRNA (pri-miRNA) i kärnan. Efter nukleär bearbetning av mikroprocessorkomplexet till prekursor-miRNA (pre-miRNA), exporteras pre-miRNA till cytoplasman, där de genomgår ytterligare bearbetning av RNas III-endonukleas, dicer till 21-23 nukleotidmogna miRNA-duplexer1. En av strängarna i det bearbetade mogna miRNA:t binder till målbudbärar-RNA (mRNA), vilket leder till nedbrytning eller translationell repression av måltavlorna2. Baserat på miRNA:s pleiotropa roll i att samtidigt reglera flera olika mål-mRNA är det inte förvånande att miRNA-uttrycket är hårt reglerat3. Faktum är att olämpligt uttryck bidrar till olika sjukdomstillstånd, särskilt vid cancer. Det avvikande uttrycket av miRNA representerar inte bara en sjukdomsspecifik signatur utan har också visat sig vara ett mål för prognostisk och terapeutisk potential 4,5,6. Förutom sina intracellulära roller har miRNA också icke-autonoma roller. Till exempel kan miRNA selektivt förpackas i EV av donatorceller och exporteras till mottagarplatser där de framkallar olika fenotypiska svar i normal fysiologioch sjukdomsfysiologi 7,8,9.
Trots tydliga bevis för att EV-associerade miRNA är funktionella biomolekyler, är det inte helt klarlagt hur specifika undergrupper av miRNA är dysreglerade i sjukdomstillstånd som cancer och hur cellulärt maskineri selekterar och sorterar miRNA till Evs10,11. Med tanke på den potentiella roll som EV-miRNA spelar för att modulera mikromiljön är det viktigt att identifiera de mekanismer som är involverade i exporten av utvalda miRNA för att fullt ut belysa EV:s roll i intercellulär kommunikation och sjukdomspatogenes. Att förstå processen för miRNA-frisättning i EV kommer inte bara att belysa viktiga mediatorer för miRNA-export utan kan också ge insikter om potentiella terapier. För att uppnå denna kunskapsnivå måste verktygen anpassas för att troget ta itu med dessa nya experimentella frågor. Faktum är att studier som utvärderar elbilar växer exponentiellt på grund av införandet av ny teknik och kontroller 12,13. När det gäller att utvärdera förekomsten av exporterade miRNA till EV har nästa generations sekvensering och kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) varit de nuvarande standardverktygen. Även om dessa verktyg är användbara för att utvärdera överflödet av miRNA i EV, finns det begränsningar för deras känslighet och specificitet, och att använda dessa statiska metoder för att utvärdera dynamik är otillräckligt. Att avgränsa dynamiken i miRNA-export till EV kräver en kombination av specialiserade verktyg. Här presenterar vi ett omfattande protokoll med hjälp av fluorescerande konjugerade miRNA för att analysera dynamiken i miRNA-frisättning från donatorceller och inkorporering i EV. Vi diskuterar också metodens fördelar och begränsningar och ger rekommendationer för optimal användning. Den mångsidiga metoden som presenteras i denna artikel kommer att vara användbar för forskare som är intresserade av att studera miRNA-frisättning i EV och deras potentiella roller i cellulär kommunikation och sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nyetablerade protokollet gör det möjligt att fånga kinetiken för miRNA-frisättning i EV efter transfektion av EV-miRNA. Tillvägagångssättet möjliggör samtidig analys av flera EV-miRNA och cell-miRNA, beroende på cytometerns kapacitet. Dessutom, även om flödescytometrianalys kan ge värdefulla insikter i EV miRNA-biologi, är det inte utan begränsningar. Även om vissa av begränsningarna kan övervinnas när de används tillsammans med andra tekniker för en mer omfattande förståelse.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar för stöd och råd från Dr. Jill Hutchcroft, chef för Flow Cytometry Core Facility vid Purdue University. Detta arbete stöddes av R01CA226259 och R01CA205420 till A.L.K., American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 till A.L.K., ett Purdue Shared resource facility-bidrag P30CA023168 och ett flaggskeppsstipendium från Fulbright Doctoral Scholarship som delas ut av Department of the State, USA till H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
