Generering av netthinneskademodeller i Xenopus rumpetroll
Summary
Vi har utviklet flere protokoller for å indusere retinal skade eller retinal degenerasjon i Xenopus laevis rumpetroll. Disse modellene gir mulighet for å studere retinal regenereringsmekanismer.
Abstract
Retinal neurodegenerative sykdommer er de viktigste årsakene til blindhet. Blant mange terapeutiske strategier som utforskes, har stimulerende selvreparasjon nylig dukket opp som spesielt tiltalende. En cellulær kilde av interesse for retinal reparasjon er Müller glialcelle, som har stamcellepotensial og en ekstraordinær regenerativ kapasitet i anamnioter. Dette potensialet er imidlertid svært begrenset hos pattedyr. Studier av molekylære mekanismer som ligger til grunn for retinal regenerering i dyremodeller med regenerative evner, bør gi innsikt i hvordan man låser opp pattedyrs latente Müller-cellers latente evne til å regenerere netthinnen. Dette er et viktig skritt for utviklingen av terapeutiske strategier innen regenerativ medisin. Til dette målet utviklet vi flere retinale skadeparadigmer i Xenopus: en mekanisk retinal skade, en transgen linje som tillater nitroreduktase-mediert fotoreceptor betinget ablasjon, en retinitis pigmentosa-modell basert på CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout, og en cytotoksisk modell drevet av intraokulære CoCl2-injeksjoner . Fremhever deres fordeler og ulemper, beskriver vi her denne serien av protokoller som genererer ulike degenerative forhold og tillater studiet av retinal regenerering i Xenopus.
Introduction
Millioner av mennesker over hele verden er rammet av ulike retinal degenerative sykdommer som fører til blindhet, som retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati eller aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Til dags dato forblir disse forholdene stort sett uhelbredelige. Nåværende terapeutiske tilnærminger under evaluering inkluderer genterapi, celle- eller vevstransplantasjoner, nevrobeskyttende behandlinger, optogenetikk og proteser. En annen fremvoksende strategi er basert på selvregenerering gjennom aktivering av endogene celler med stamcellepotensial. Müller gliaceller, den viktigste gliacelletypen av netthinnen, er blant cellulære kilder av interesse i denne sammenhengen. Ved skade kan de dedifferensiere, spre seg og generere nevroner 1,2,3. Selv om denne prosessen er svært effektiv i sebrafisk eller Xenopus, er den i stor grad ineffektiv hos pattedyr.
Ikke desto mindre har det vist seg at passende behandlinger med mitogene proteiner eller overekspresjon av ulike faktorer kan indusere pattedyrs Müller gliacellesyklus-re-entry og i noen tilfeller utløse deres påfølgende neurogeneseforpliktelse 1,2,3,4,5. Dette forblir imidlertid i stor grad utilstrekkelig for behandlinger. Derfor er det nødvendig å øke kunnskapen om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for regenerering for å identifisere molekyler som effektivt kan omdanne Müllers stamlignende celleegenskaper til nye cellulære terapeutiske strategier.
Med dette målet utviklet vi flere skadeparadigmer i Xenopus som utløser retinalcelledegenerasjon. Her presenterer vi (1) en mekanisk retinal skade som ikke er celletypespesifikk, (2) en betinget og reversibel celleablasjonsmodell ved bruk av NTR-MTZ-systemet som retter seg mot stavceller, (3) en CRISPR / Cas9-mediert rhodopsin knockout, en modell av retinitis pigmentosa som utløser progressiv stavcelledegenerasjon, og (4) en CoCl2-indusert cytotoksisk modell som i henhold til dosen spesifikt kan målrette tapper eller føre til bredere retinal celledegenerasjon. Vi fremhever særegenheter, fordeler og ulemper ved hvert paradigme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordeler og ulemper ved ulike retinal skade paradigmer i Xenopus rumpetroll
Mekanisk netthinneskade
Ulike kirurgiske skader i nevrale netthinnen er utviklet i Xenopus rumpetroll. Den nevrale netthinnen kan enten fjernes helt 15,16 eller bare delvis skåret ut16,17. Den mekaniske skaden som presenteres her innebærer ingen r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av tilskudd til MP fra Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) og UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) i samarbeid med ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. 발생학. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
