Vi har utvecklat flera protokoll för att inducera näthinneskada eller näthinnedegeneration hos Xenopus laevis grodyngel. Dessa modeller ger möjlighet att studera mekanismer för näthinneregenerering.
Näthinnans neurodegenerativa sjukdomar är de främsta orsakerna till blindhet. Bland de många terapeutiska strategier som utforskas har stimulering av självläkning nyligen framstått som särskilt tilltalande. En cellulär källa av intresse för näthinnereparation är Müller-gliacellen, som har stamcellspotential och en extraordinär regenerativ kapacitet i anamnioter. Denna potential är dock mycket begränsad hos däggdjur. Att studera de molekylära mekanismerna bakom retinal regenerering i djurmodeller med regenerativ förmåga bör ge insikter om hur man kan låsa upp den latenta förmågan hos däggdjurs Müller-celler att regenerera näthinnan. Detta är ett viktigt steg för utvecklingen av terapeutiska strategier inom regenerativ medicin. För detta ändamål utvecklade vi flera paradigm för näthinneskada i Xenopus: en mekanisk näthinneskada, en transgen linje som möjliggör nitroreduktasmedierad fotoreceptorbetingad ablation, en retinitis pigmentosa-modell baserad på CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout och en cytotoxisk modell som drivs av intraokulära CoCl2-injektioner . För att belysa deras fördelar och nackdelar beskriver vi här denna serie protokoll som genererar olika degenerativa tillstånd och gör det möjligt att studera retinal regenerering hos Xenopus.
Miljontals människor världen över drabbas av olika degenerativa sjukdomar i näthinnan som leder till blindhet, såsom retinitis pigmentosa, diabetisk retinopati eller åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Hittills är dessa tillstånd i stort sett obehandlingsbara. Nuvarande terapeutiska metoder som utvärderas inkluderar genterapi, cell- eller vävnadstransplantationer, neuroprotektiva behandlingar, optogenetik och proteser. En annan framväxande strategi är baserad på självregenerering genom aktivering av endogena celler med stamcellspotential. Müller-gliaceller, den huvudsakliga gliacellstypen i näthinnan, är bland cellulära källor av intresse i detta sammanhang. Vid skada kan de dedifferentiera, föröka sig och generera neuroner 1,2,3. Även om denna process är mycket effektiv hos zebrafiskar eller Xenopus, är den i stort sett ineffektiv hos däggdjur.
Icke desto mindre har det visats att lämpliga behandlingar med mitogena proteiner eller överuttryck av olika faktorer kan inducera återinträde i Müllers gliacellcykel hos däggdjur och, i vissa fall, utlösa deras efterföljande neurogenesåtagande 1,2,3,4,5. Detta är dock fortfarande i stort sett otillräckligt för behandlingar. Därför är det nödvändigt att öka vår kunskap om de molekylära mekanismerna bakom regenerering för att identifiera molekyler som effektivt kan omvandla Müllers stamliknande cellegenskaper till nya cellulära terapeutiska strategier.
Med detta mål utvecklade vi flera skadeparadigm i Xenopus som utlöser degeneration av näthinneceller. Här presenterar vi (1) en mekanisk näthinneskada som inte är celltypsspecifik, (2) en betingad och reversibel cellablationsmodell med NTR-MTZ-systemet som riktar sig mot stavceller, (3) en CRISPR/Cas9-medierad rhodopsin-knockout , en modell av retinitis pigmentosa som utlöser progressiv stavcellsdegeneration, och (4) en CoCl2-inducerad cytotoxisk modell som beroende på dosen specifikt kan rikta in sig på tappar eller leda till bredare degeneration av näthinneceller. Vi lyfter fram särdragen, fördelarna och nackdelarna med varje paradigm.
För- och nackdelar med olika paradigm för näthinneskador hos Xenopus grodyngel
Mekanisk näthinneskada
Olika kirurgiska skador på näthinnan har utvecklats hos Xenopus grodyngel. Näthinnan kan antingen avlägsnas helt15,16 eller endast delvis avlägsnas16,17. Den mekaniska skadan som presenteras här innebär inte någ…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av bidrag till MP från Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) och UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) i samarbete med ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
Pestle | VWR | 431-0094 | |
Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |