استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.
Abstract
شبكة الأنابيب الدقيقة هي عنصر أساسي في الجهاز العصبي. ترتبط الطفرات في العديد من البروتينات التنظيمية للأنابيب الدقيقة باضطرابات النمو العصبي والأمراض العصبية ، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة للأمراض التنكسية العصبية ، وبروتين قطع الأنابيب الدقيقة Spastin و Katanin 60 يسبب الشلل النصفي التشنجي الوراثي وتشوهات النمو العصبي ، على التوالي. يعد الكشف عن شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مفيدا لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم الخلايا العصبية والترتيب الكثيف لحزم الأنابيب الدقيقة المحورية يجعل تصور شبكات الأنابيب الدقيقة أمرا صعبا. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتشريح الوصلة العصبية العضلية اليرقية وخلايا العضلات ، وكذلك التلوين المناعي لبروتين α-tubulin والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة Futsch لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في ذبابة الفاكهة الميلانية. يسمح لنا التقاطع العصبي العضلي بمراقبة كل من الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ، ويسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. هنا ، من خلال تحور والإفراط في التعبير عن Katanin 60 في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ثم فحص شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلة العصبية العضلية وخلايا العضلات ، نكشف بدقة عن الدور التنظيمي ل Katanin 60 في النمو العصبي. لذلك ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.
Introduction
تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) ، باعتبارها أحد المكونات الهيكلية للهيكل الخلوي ، دورا مهما في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، ونمو الخلايا وحركتها ، والنقل داخل الخلايا ، والحفاظ على شكل الخلية. يتم تعديل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ووظيفتها من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى ، مثل MAP1 و MAP2 و Tau و Katanin و Kinesin1،2،3،4،5.
في الخلايا العصبية ، الأنابيب الدقيقة ضرورية لتطوير وصيانة المحاور العصبية والتغصنات. تشوهات في الأنابيب الدقيقة تؤدي إلى خلل وظيفي وحتى موت الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في دماغ مرضى الزهايمر ، يقلل فرط فسفرة بروتين تاو من استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة ، مما يسبب مخالفات عصبية6. وبالتالي ، فإن فحص شبكات الأنابيب الدقيقة سيساهم في فهم النمو العصبي والتسبب في الأمراض العصبية.
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي المتشكل بين طرف محور عصبي للخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية ، وهو نظام نموذجي ممتاز وقوي لدراسة البنية والوظائف المشبكية7. Futsch هو بروتين في ذبابة الفاكهة متماثل مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة MAP1B الموجود في الثدييات8. يتم التعبير عنه فقط في الخلايا العصبية ويلعب دورا في تطوير الأزرار المشبكية ل NMJ 8,9. في النوع البري ، يتم تصور الحزم الخيطية التي تعمل على طول مركز عمليات NMJ عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد Futsch. عند الوصول إلى نهاية NMJ ، تتمتع هذه الحزمة إما بالقدرة على تكوين حلقة تتكون من الأنابيب الدقيقة أو فقدان هيكلها الخيطي ، مما يؤدي إلى ظهور منتشر ومنقط10. ترتبط حلقات الأنابيب الدقيقة بمخاريط النمو المتوقفة مؤقتا ، مما يشير إلى أن مجموعة الأنابيب الدقيقة مستقرة11. لذلك ، يمكننا بشكل غير مباشر تحديد تطور الأنابيب الدقيقة المستقرة في NMJ عن طريق تلطيخ Futsch. يسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. يمكن العثور على العوامل التي تؤثر على استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال تحليل كثافة وشكل الأنابيب الدقيقة. في الوقت نفسه ، يمكن التحقق من حالة شبكة الأنابيب الدقيقة لخلايا العضلات بنتيجة NMJ للحصول على استنتاجات أكثر شمولا.
تم استخدام العديد من البروتوكولات للتحقيق في شبكة وديناميكيات الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الأبحاث في كثير من الأحيان على الدراسات في المختبر 12،13،14،15،16. بدلا من ذلك ، استخدمت بعض التجارب في الجسم الحي المجهر الإلكتروني للكشف عن الهيكل الخلوي17. وفقا للارتباط المحدد للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية أو الأصباغ الكيميائية بالبروتينات أو الحمض النووي ، تسمح الطرق المعروضة هنا باكتشاف شبكات الأنابيب الدقيقة في NMJ على مستوى الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي ، مع النتائج التي تؤكدها الملاحظات في خلايا العضلات. هذا البروتوكول بسيط ومستقر وقابل للتكرار عند دمجه مع الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، مما يتيح مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري والفحوصات الجينية لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يتم وصف بروتوكول للتشريح والمناعة من ذبابة الفاكهة اليرقات الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. هناك العديد من النقاط الأساسية التي يجب مراعاتها. أولا ، يعد تجنب إصابة العضلات المرصودة أمرا بالغ الأهمية أثناء عملية التشريح. قد يكون من المفيد إصلاح شرائح اللحم قبل إزالة الأعض?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور يينغ شيونغ على المناقشات والتعليقات على المخطوطة. يتم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC) إلى C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
