Her præsenterer vi en detaljeret protokol til visualisering af mikrotubulusnetværkene i neuromuskulære kryds og muskelceller. Kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer i Drosophila melanogaster letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulus-dynamikanalyse for mikrotubulusnetværksregulerende proteiners rolle i nervesystemet.
Mikrotubulusnetværket er en væsentlig bestanddel af nervesystemet. Mutationer i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er forbundet med neurodevelopmental lidelser og neurologiske sygdomme, såsom mikrotubulus-associeret protein Tau til neurodegenerative sygdomme, mikrotubulus skæreprotein Spastin og Katanin 60 forårsager henholdsvis arvelige spastiske paraplegi og neurodevelopmental abnormiteter. Påvisning af mikrotubulusnetværk i neuroner er fordelagtigt til belysning af patogenesen af neurologiske lidelser. Imidlertid gør den lille størrelse af neuroner og det tætte arrangement af aksonale mikrotubulusbundter visualisering af mikrotubulusnetværkene udfordrende. I dette studie beskriver vi en metode til dissektion af larvens neuromuskulære kryds og muskelceller samt immunfarvning af α-tubulin og mikrotubulusassocieret protein Futsch for at visualisere mikrotubulusnetværk i Drosophila melanogaster. Det neuromuskulære kryds tillader os at observere både præ- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelse af muskelceller i Drosophila-larven muliggør klar visualisering af mikrotubulusnetværket. Her, ved at mutere og overudtrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster og derefter undersøge mikrotubulusnetværkene i det neuromuskulære kryds og muskelceller, afslører vi nøjagtigt Katanin 60’s regulerende rolle i neuroudvikling. Derfor, kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer af Drosophila melanogaster, letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulusdynamikanalyse for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet.
Mikrotubuli (MT’er), som en af cytoskeletets strukturelle komponenter, spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer, herunder celledeling, cellevækst og motilitet, intracellulær transport og vedligeholdelse af celleform. Mikrotubulus dynamik og funktion moduleres af interaktioner med andre proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.
I neuroner er mikrotubuli afgørende for udvikling og vedligeholdelse af axoner og dendritter. Abnormiteter i mikrotubuli fører til dysfunktion og endda neuronernes død. For eksempel reducerer Tau-proteinhyperphosphorylering i hjernen hos Alzheimers patienter stabiliteten af mikrotubulusnetværket og forårsager neurologiske uregelmæssigheder6. Således vil undersøgelse af mikrotubulusnetværk bidrage til en forståelse af neuroudvikling og patogenesen af neurologiske sygdomme.
Det neuromuskulære kryds (NMJ) er den perifere synaps dannet mellem en motorneuronaxonterminal og en muskelfiber, som er et fremragende og kraftfuldt modelsystem til undersøgelse af synaptisk struktur og funktioner7. Futsch er et protein i Drosophila, der er homologt med det mikrotubulusbindende protein MAP1B, der findes hos pattedyr8. Det udtrykkes kun i neuroner og spiller en rolle i udviklingen af NMJ’s synaptiske knapper 8,9. I vildtype visualiseres filamentøse bundter, der løber langs midten af NMJ-processer, ved immunfarvning med anti-Futsch. Når NMJ’s ende nås, har dette bundt evnen til enten at danne en løkke bestående af mikrotubuli eller at miste sin trådformede struktur, hvilket resulterer i et diffust og punkteret udseende10. Mikrotubulussløjfer er forbundet med pausede vækstkegler, hvilket tyder på, at mikrotubulusarrayet er stabilt11. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubulusudvikling i NMJ ved Futsch-farvning. Den store størrelse af muskelceller i Drosophila larve giver mulighed for klar visualisering af mikrotubulusnetværket. De faktorer, der påvirker stabiliteten af mikrotubulusnetværket, kan findes ved at analysere tætheden og formen af mikrotubuli. Samtidig kan muskelcellernes mikrotubulusnetværksstatus krydsverificeres med resultatet af NMJ for at opnå mere omfattende konklusioner.
Mange protokoller er blevet anvendt til at undersøge mikrotubulis netværk og dynamik. Imidlertid har disse undersøgelser ofte fokuseret på in vitro-undersøgelser 12,13,14,15,16. Alternativt har nogle in vivo-eksperimenter anvendt elektronmikroskopi til at detektere cytoskelettet17. Ifølge den specifikke binding af fluorescerende mærkede antistoffer eller kemiske farvestoffer til proteiner eller DNA tillader de metoder, der præsenteres her, påvisning af mikrotubulusnetværk i NMJ på niveauet af individuelle neuroner in vivo, med resultater bekræftet af observationer i muskelceller. Denne protokol er enkel, stabil og gentagelig, når den kombineres med de kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila melanogaster, hvilket muliggør en bred vifte af fænotypiske undersøgelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet in vivo.
Her beskrives en protokol til dissektion og immunfarvning af Drosophila-larve , neuromuskulære krydsninger og muskelceller. Der er flere vigtige punkter at overveje. For det første er det afgørende at undgå skade på de observerede muskler under dissektionsprocessen. Det kan være værd at fastgøre fileten, før du fjerner indre organer for at forhindre direkte kontakt mellem tang og muskler. For at undgå muskelskader eller adskillelse fra larveepidermis er det vigtigt at sikre, at rysterens hastighed ikke…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Ying Xiong for diskussioner og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde er støttet af en bevilling fra National Science Foundation of China (NSFC) til CM (31500839).
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
Tweezers | dumont | 500342 |