ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化
Summary
ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ ジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubule原動力の分析を非常に促進する。
Abstract
微小管ネットワークは、神経系の不可欠な構成要素です。多くの微小管調節タンパク質の変異は、神経発達障害や神経疾患に関連しており、微小管関連タンパク質タウから神経変性疾患、微小管切断タンパク質スパスチンおよびカタニン60は、それぞれ遺伝性痙性対麻痺および神経発達異常を引き起こします。神経細胞内の微小管ネットワークの検出は、神経疾患の病態解明に有利である。しかし、ニューロンのサイズが小さく、軸索微小管束が密集しているため、微小管ネットワークの可視化は困難です。本研究では、ショウジョウバエの微小管ネットワークを可視化するために、幼虫の神経筋接合部と筋細胞を解剖し、α-チューブリンと微小管関連タンパク質Futschの免疫染色を行う方法について述べる。神経筋接合部はシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管を観察することを可能にし、ショウジョウバエ幼虫の筋肉細胞のサイズは微小管ネットワークの明瞭な可視化を可能にします。本研究では、ショウジョウバエのカタニン60を変異させて過剰発現させ、神経筋接合部や筋細胞の微小管ネットワークを調べることで、神経発達におけるカタニン60の制御的役割を正確に明らかにしました。従って、ショウジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定する蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubuleの原動力の分析を非常に促進する。
Introduction
微小管(MT)は、細胞骨格を構成する構成要素の1つとして、細胞分裂、細胞増殖と運動性、細胞内輸送、細胞形状の維持など、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。微小管の動態と機能は、MAP1、MAP2、タウ、カタニン、キネシンなどの他のタンパク質との相互作用によって調節されます1,2,3,4,5。
ニューロンでは、微小管は軸索と樹状突起の発達と維持に不可欠です。微小管の異常は、機能不全やニューロンの死さえも引き起こします。例えば、アルツハイマー病患者の脳では、タウタンパク質の過剰リン酸化により微小管ネットワークの安定性が低下し、神経学的不規則性が引き起こされます6。したがって、微小管ネットワークを調べることは、神経発達と神経疾患の病因の理解に貢献します。
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンの軸索末端と筋線維の間に形成される末梢シナプスであり、シナプスの構造と機能を研究するための優れた強力なモデルシステムです7。フッチはショウジョウバエのタンパク質で、哺乳類に見られる微小管結合タンパク質MAP1Bと相同である8。ニューロンにのみ発現し、NMJのシナプスボタンの発達に関与している8,9。野生型では、NMJ突起の中心に沿って走る糸状束を抗Futschで免疫染色することで可視化します。NMJの末端に達すると、この束は微小管からなるループを形成するか、またはその糸状構造を失い、びまん性および点状の外観をもたらす能力を有する10。微小管ループは一時停止した成長円錐と関連しており、微小管アレイが安定していることを示唆している11。そのため、フッチ染色によりNMJにおける微小管の安定な発生を間接的に決定することができます。ショウジョウバエの幼虫の筋肉細胞のサイズが大きいため、微小管ネットワークを明確に視覚化できます。微小管ネットワークの安定性に影響を与える要因は、微小管の密度と形状を分析することで見つけることができます。同時に、筋肉細胞の微小管ネットワークの状態をNMJの結果と交差検証して、より包括的な結論を得ることができます。
微小管のネットワークとダイナミクスを調べるために、多くのプロトコルが採用されています。しかし、これらの研究はしばしばin vitro研究に焦点を当てている12,13,14,15,16。或いは、いくつかのin vivo実験では、細胞骨格を検出するために電子顕微鏡法が用いられている17。蛍光標識抗体または化学色素のタンパク質またはDNAへの特異的結合によると、ここで紹介する方法により、NMJの微小管ネットワークをin vivoの個々のニューロンレベルで検出することができ、その結果は筋肉細胞での観察によって裏付けられています。このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスターで利用可能な強力な遺伝ツールと組み合わせると、シンプルで安定しており、反復性があり、生体内の神経系における微小管ネットワーク調節タンパク質の役割について、多様な表現型検査および遺伝子スクリーニングを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部および筋肉細胞の解剖および免疫染色に関するプロトコルについて説明します。考慮すべき重要なポイントがいくつかあります。まず、解剖プロセスでは、観察された筋肉の損傷を避けることが重要です。鉗子と筋肉の直接接触を防ぐために、内臓を切除する前にフィレットを固定する価値があるかもしれません。筋肉の損傷や幼?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
論文に関する議論とコメントをしてくれたYing Xiong博士に感謝します。この研究は、中国国家科学基金会(NSFC)からC.M.(31500839)への助成金によって支援されています。
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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