Modellering av multipel skleros hos de två könen: MOG35-55-inducerad experimentell autoimmun encefalomyelit
Summary
Experimentell autoimmun encefalomyelit är en av de mest använda murina modellerna av multipel skleros. I det nuvarande protokollet immuniseras C57BL/6J-möss av båda könen med myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid, vilket huvudsakligen resulterar i stigande pares av svans och lemmar. Här diskuterar vi protokollet för EAE-induktion och utvärdering.
Abstract
Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun inflammatorisk sjukdom som påverkar det centrala nervsystemet (CNS). Den kännetecknas av olika prevalens hos könen, som drabbar fler kvinnor än män, och olika resultat, som visar mer aggressiva former hos män än hos kvinnor. Dessutom är MS mycket heterogent när det gäller kliniska aspekter, radiologiska och patologiska egenskaper. Därför är det nödvändigt att dra nytta av experimentella djurmodeller som gör det möjligt att undersöka så många aspekter av patologin som möjligt. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en av de mest använda modellerna av MS hos möss och modellerar olika sjukdomsegenskaper, från aktivering av immunsystemet till CNS-skador. Här beskriver vi ett protokoll för induktion av EAE hos både han- och honmöss av typen C57BL/6J med myelinoligodendrocytglykoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) immunisering, vilket leder till utveckling av en kronisk form av sjukdomen. Vi rapporterar också utvärderingen av den dagliga kliniska poängen och motoriska prestandan hos dessa möss under 28 dagar efter immunisering (28 dpi). Slutligen illustrerar vi några grundläggande histologiska analyser på CNS-nivå, med fokus på ryggmärgen som den primära platsen för sjukdomsinducerad skada.
Introduction
Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun inflammatorisk sjukdom som påverkar det centrala nervsystemet (CNS). Den visar närvaron av perivaskulär infiltration av inflammatoriska celler, demyelinisering, axonal förlust och glios1. Dess etiologi är fortfarande okänd, och dess kliniska aspekter, röntgenologiska och patologiska egenskaper tyder på anmärkningsvärd heterogenitet i sjukdomen2.
På grund av dess okända etiologi och komplexitet finns det för närvarande ingen djurmodell som rekapitulerar alla de kliniska och radiologiska egenskaper som uppvisas i MS 3,4 hos människa. Olika djurmodeller används dock för att studera olika aspekter av MS 3,4. I dessa modeller är sjukdomsinitieringen vanligtvis extremt artificiell, och tidsramen för uppkomsten av kliniska tecken skiljer sig åt mellan människor och möss. Till exempel hos människor är de patofysiologiska processer som ligger till grund för sjukdomen oupptäckta i åratal innan de kliniska manifestationerna börjar. Omvänt kan försöksledarna upptäcka symtom i djurmodeller inom veckor eller till och med dagar efter MS-induktion4.
Tre grundläggande djurmodeller ger de egenskaper hos demyelinisering som är karakteristiska för MS: de som är virusinducerade (t.ex. Theilers murina encefalomyelitvirus), de som induceras av toxiska ämnen (t.ex. cuprizon, lysolecitin) och de olika varianterna av experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE)5. Varje modell hjälper till att studera vissa specifika aspekter av sjukdomen, men ingen replikerar alla egenskaper hos MS6. Därför är det viktigt att välja rätt modell med tanke på de specifika experimentella behoven och de vetenskapliga frågor som ska behandlas.
Tack vare immuniseringsprocedurer mot myelin-härledda antigener induceras EAE genom att utlösa ett autoimmunt svar på CNS-komponenter hos mottagliga möss. Samspelet mellan ett brett spektrum av immunpatologiska och neuropatologiska mekanismer orsakar utvecklingen av de huvudsakliga patologiska dragen hos MS (dvs. inflammation, demyelinisering, axonal förlust och glios) hos de immuniserade mössen 7,8. Möss börjar visa kliniska symtom runt den andra veckan efter immunisering och visar i allmänhet stigande förlamning från svansen till extremiteten och frambenen. Den kliniska poängen (dvs. kvantifiering av ackumuleringen av sjukdomsrelaterade brister) bedöms i allmänhet med hjälp av en 5-gradig skala7.
Aktiv immunisering med protein eller peptid eller passiv överföring av encefalitogena T-celler kan användas för att inducera EAE hos möss med olika genetisk bakgrund (t.ex. SJL/J, C57BL/6 och icke-överviktiga diabetiska (NOD) möss). Myelinproteolipidprotein (PLP), myelinbasprotein (MBP) och myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) är exempel på själv-CNS-proteiner från vilka immunogener vanligtvis produceras. Särskilt SJL/J-möss som immuniserats med den immundominanta epitopen PLP (PLP139−151) utvecklar ett skovvis förlöpande sjukdomsförlopp (RR), medan C57BL/6J-möss immuniserade med den immundominanta MOG35-55-peptiden uppvisar EAE av kronisk natur1. Trots vissa begränsningar, såsom att ge mycket lite information om MS-progression, B-cellernas roll i sjukdomen, inifrån och ut-mekanismerna eller svårigheter att studera remyelinisering, har EAE-modellerna i hög grad bidragit till förståelsen av autoimmuna och neuroinflammatoriska processer, ökat kunskapen inom MS-området och därmed möjliggjort utveckling av nya terapeutiska metoder för denna sjukdom4, 6. veckor
I detta arbete fokuserade vi på en särskild form av aktiv EAE, myelinoligodendrocytglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-inducerad form 9,10,11,12. MOG35-55-inducerad EAE modellerar en kronisk form av MS. Efter immunisering genomgår mössen en asymtomatisk fas inom den första veckan efter immunisering, sedan uppstår sjukdomen vanligtvis under den andra veckan efter immunisering, medan mellan den tredje och fjärde veckan efter immunisering blir sjukdomen kronisk, utan möjlighet till full återhämtning från de ackumulerade underskotten 7,8,13. Intressant nog observeras inga skillnader mellan män och kvinnor i incidens, sjukdomsdebut, förlopp eller progression i de flesta av de studier som finns i litteraturen14, även om färre studier jämför sjukdomen hos män och kvinnor.
Hos människor är dessa parametrar däremot kända för att vara starkt könsdimorfa2. MS drabbar fler kvinnor än män. Män utvecklar dock i allmänhet en mer aggressiv form av sjukdomen2. Dessa bevis har antytt en viktig, såväl som komplex, roll för gonadhormonerna15; Ändå är könshormonernas roll och verkningsmekanism i patologin fortfarande oklar. Dessutom stöder data från djurmodeller idén att både östrogener och androgener utövar positiva effekter på olika delar av patologin på ett könsspecifikt sätt16,17.
Vissa studier tyder också på neuroprotektiva, promyeliniserande och antiinflammatoriska effekter av progesteron18 och, även om bevisen hos MS-patienter är knapphändiga18, kan neuroaktiva steroider (dvs. de novo-syntetiserade steroider av nervsystemet, såsom pregnenolon, tetrahydroprogesteron och dihydroprogesteron) också påverka det patologiska förloppet19. Sammantaget stöder dessa data idén att könshormoner som produceras både perifert och inuti CNS har en viktig och könsspecifik roll i sjukdomsdebut och progression. Därför uppmanar vi i detta arbete till insamling av separata data från både han- och hondjur.
Ur histopatologisk synvinkel fungerar ryggmärgens vita substans som den huvudsakliga platsen för CNS-skada i denna modell, som kännetecknas av multifokala, sammanflytande regioner av mononukleär inflammatorisk infiltration och demyelinisering8. Således, när vi beskriver detta protokoll för induktion av MOG35-55-inducerad EAE i C57BL/6J-möss, kommer vi att ta hänsyn till sjukdomsutfallet hos de två könen och ge några histopatologiska insikter om ryggmärgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det MOG35-55-inducerade EAE-protokollet som vi beskrev ledde till utvecklingen av en kronisk form av MS i C57BL/6J-möss 7,8,13. I dessa representativa resultat rapporterade vi att djuren av båda könen som genomgick immuniseringsproceduren utvecklade en kronisk form av sjukdomen (dvs. de återhämtar sig inte helt efter sjukdomsdebuten, de ackumulerar underskott och bibehåller ett CS på minst 1,5 i den kroniska fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har fått stöd av Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR-projektet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 och 2023-2027 till Institutionen för neurovetenskap Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi-stiftelsen, Orbassano, Italien. BB var stipendiat vid INFRA-P, Piemonte-regionen (n.378-35) (2022-2023) och PRIN 2020-20203AMKTW. Vi tackar Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) för stödet. Utgivningsavgifterna har finansierats av en donation från Distretto Rotaract 2031, och i synnerhet Rotaract Club Torino Nord-Est. Vi tackar Elaine Miller för korrekturläsningen av vårt manus.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
References
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
