Chimeric Small Noncoding RNA에 대한 전산 분석 튜토리얼: 표적 RNA 염기서열분석 라이브러리
Summary
여기에서는 in vivo RNA:RNA 상호 작용 연구에 사용되는 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터를 분석하기 위한 생물정보학 파이프라인의 설치 및 사용을 보여주는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
microRNA(miRNA)와 같은 작은 비코딩 RNA(sncRNA)와 표적 RNA의 생체 내 유전자 조절 상호 작용에 대한 이해는 키메라 RNA 및 후속 염기서열 분석 라이브러리의 형성을 통해 sncRNA:표적 RNA 상호 작용을 포착하기 위해 교차 결합 후 결찰을 사용하는 생화학적 접근 방식에 의해 최근 몇 년 동안 발전되었습니다. 키메라 RNA 염기서열 분석의 데이터 세트는 miRNA 예측 소프트웨어보다 게놈 전체에 대한 모호성이 훨씬 적은 입력을 제공하지만, 이 데이터를 의미 있고 실행 가능한 정보로 추출하려면 추가 분석이 필요하며 계산 배경이 부족한 연구자를 설득할 수 있습니다. 이 보고서는 초급 컴퓨터 생물학자가 최신 오픈 소스 소프트웨어 도구인 SCRAP(Small Chimeric RNA Analysis Pipeline)를 설치하고 적용할 수 있도록 지원하는 자습서를 제공합니다. 플랫폼 요구 사항, 업데이트, 파이프라인 단계 및 주요 사용자 입력 변수 조작에 대한 설명이 제공됩니다. 생물학자가 키메라 RNA 염기서열 분석 접근법에서 통찰력을 얻을 수 있는 장벽을 줄이면 여러 생물학적 맥락에서 조절 sncRNA:표적 RNA 상호 작용에 대한 발견 기반 조사를 시작할 수 있습니다.
Introduction
작은 비코딩 RNA는 분화 및 발달, 신호 처리 및 질병과 같은 다양한 과정에서 유전자 제품군의 발현을 조정하는 전사 후 역할에 대해 고도로 연구되고 있습니다 1,2,3. microRNA(miRNA)를 포함한 유전자 조절 소형 비코딩 RNA(sncRNA)의 표적 전사체를 정확하게 결정하는 능력은 기본 및 번역 수준 모두에서 RNA 생물학 연구에 중요합니다. miRNA 시드 서열과 잠재적 표적 사이의 예상되는 상보성을 활용하는 생물정보학 알고리즘은 miRNA:표적 RNA 상호작용의 예측에 자주 사용되어 왔습니다. 이러한 생물정보학 알고리즘은 성공적이었지만 다른 곳에서 검토된 바와 같이 위양성 및 위음성 결과를 모두 보유할 수도 있습니다 4,5,6. 최근에, 단일 키메라 RNA 4,5,7,8,9,10을 형성하기 위해 sncRNA를 표적에 물리적으로 부착하기 위한 ligation 단계의 in vivo 교차결합 및 후속 통합에 의한 in vivo sncRNA:target RNA 상호작용의 모호하지 않고 반정량적인 결정을 가능하게 하는 몇 가지 생화학적 접근법이 설계 및 구현되었습니다 . 키메라 RNA로부터 염기서열분석 라이브러리의 후속 준비를 통해 염기서열분석 데이터의 전산 처리를 통해 sncRNA:표적 RNA 상호작용을 평가할 수 있습니다. 이 비디오는 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 sncRNA:표적 RNA 상호 작용의 강력하고 재현 가능한 분석을 허용하도록 설계된 소형 키메라 RNA 분석 파이프라인(SCRAP)이라는 계산 파이프라인을 설치하고 사용하는 방법에 대한 자습서를 제공합니다6.
이 튜토리얼의 목표는 sncRNA:표적 RNA 상호 작용의 키메라 분자 판독을 제공하는 생화학적 접근 방식을 통해 생성된 데이터 분석에 대한 장벽을 낮춤으로써 연구자가 순수 예측 생물정보학 알고리즘에 대한 과도한 의존을 피할 수 있도록 지원하는 것입니다. 이 튜토리얼은 하이브리드의 교차결합, 연결 및 염기서열분석(CLASH) 및 내인성 아르고나우트 결합 RNA의 공유 결합 및 면역침전(CLEAR-CLIP)7,9을 포함한 여러 기존 생화학 프로토콜에 의해 생성될 수 있는 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터를 분석하기 위해 개발된 파이프라인 SCRAP을 사용하여 초급 컴퓨터 과학자를 안내하는 실용적인 단계와 팁을 제공합니다.
SCRAP의 사용은 다른 계산 파이프라인에 비해 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터 분석에 몇 가지 이점을 제공한다6. 한 가지 두드러진 장점은 파이프라인의 단계에 대해 사용자 지정 및/또는 지원되지 않는 스크립트에 의존하는 대체 파이프라인과 비교하여 파이프라인 내에서 잘 지원되고 정기적으로 업데이트되는 생물정보학 스크립트에 대한 광범위한 주석과 콜아웃의 통합입니다. 이 기능은 SCRAP에 안정성을 부여하여 연구원이 파이프라인에 익숙해지고 워크플로에 사용을 통합하는 데 더 가치가 있습니다. SCRAP는 또한 sncRNA:target RNA 상호 작용의 피크를 호출하는 데 있어 대체 파이프라인을 능가하는 것으로 입증되었으며, 이전 간행물6에 자세히 설명된 바와 같이 플랫폼 간 기능을 갖는 것으로 입증되었습니다.
이 자습서를 마치면 사용자는 (i) SCRAP에 대한 플랫폼 요구 사항을 파악하고 SCRAP 파이프라인을 설치하고, (ii) 참조 게놈을 설치하고 SCRAP에 대한 명령줄 매개 변수를 설정하고, (iii) 피크 호출 기준을 이해하고 피크 호출 및 피크 주석을 수행할 수 있습니다.
이 비디오는 RNA 생물학을 연구하는 연구원이 염기서열분석 라이브러리 준비에 대한 논의된 생화학적 접근 방식 중 하나를 통해 얻은 키메라 RNA 염기서열분석 데이터에서 전령 RNA와 같은 표적 RNA와의 sncRNA 상호 작용을 분석하기 위해 계산 파이프라인인 SCRAP를 설치하고 최적으로 사용하는 방법을 실용적으로 자세히 설명합니다.
SCRAP는 명령줄 유틸리티입니다. 일반적으로 아래 가이드에 따라 사용자는 (i) SCRAP(https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP)를 다운로드하여 설치하고, (ii) 참조 게놈을 설치하고 SCRAP를 실행하고, (iii) 피크 호출 및 주석을 수행해야 합니다.
이 절차의 계산 단계에 대한 자세한 내용은 https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP 에서 확인할 수 있습니다. 이 기사에서는 초급 수준의 계산 기술을 갖춘 연구자가 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리 데이터 세트에 SCRAP를 설치, 최적화 및 사용할 수 있도록 설정 및 배경 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
sncRNA:target RNA 상호 작용 분석을 위한 SCRAP 파이프라인 사용에 대한 이 프로토콜은 전산 분석을 시작하는 연구자를 지원하기 위해 설계되었습니다. 이 튜토리얼을 완료하면 초급 이상의 계산 경험이 있는 연구자에게 이 파이프라인과 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 얻은 데이터를 분석하기 위한 애플리케이션의 설치 및 사용에 필요한 단계를 안내할 수 있을 것으로 예상됩니다. 이 프로?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
파이프라인의 설치 및 구현에 대한 중요한 피드백을 제공해 주신 BH Powell 및 WT Mills IV를 포함하여 유용한 토론을 해주신 Meffert 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Braude Foundation 상, Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, Blaustein Endowment for Pain Research and Education 상, NINDS RO1NS103974 및 NIMH RO1MH129292 to M.K.M.의 지원을 받았습니다.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
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