تطوير وتحسين نموذج عضوي مشتق من سرطان الخلايا الكبدية البشرية لتحديد الهدف المحتمل واكتشاف الأدوية
Summary
نحن نقدم نظرة عامة شاملة وصقل البروتوكولات الحالية لتشكيل سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، والتي تشمل جميع مراحل زراعة الأعضاء العضوية. ويعمل هذا النظام كنموذج قيم لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة وتقييم فعالية الأدوية المرشحة.
Abstract
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو ورم منتشر ومميت للغاية في جميع أنحاء العالم ، واكتشافه المتأخر وعدم وجود عوامل علاجية محددة فعالة يستلزم مزيدا من البحث في التسبب في المرض والعلاج. حظيت الكائنات العضوية ، وهي نموذج جديد يشبه إلى حد كبير أنسجة الورم الأصلية ويمكن زراعتها في المختبر ، باهتمام كبير في السنوات الأخيرة ، مع العديد من التقارير حول تطوير نماذج عضوية لسرطان الكبد. في هذه الدراسة ، نجحنا في تحسين الإجراء وإنشاء بروتوكول استزراع يتيح تكوين عضويات HCC أكبر حجما مع ظروف مرور وثقافة مستقرة. لقد حددنا بشكل شامل كل خطوة من خطوات الإجراء ، والتي تغطي العملية الكاملة لتفكك أنسجة سرطان الكبد ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش ، وقدمنا احتياطات مفصلة في هذه الورقة. تظهر هذه الكائنات العضوية تشابها وراثيا مع أنسجة سرطان الكبد الأصلية ويمكن استخدامها في تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك تحديد الأهداف العلاجية المحتملة للأورام وتطوير الأدوية اللاحقة.
Introduction
حظي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، وهو ورم منتشر ومتنوع على نطاق واسع1 ، باهتمام كبير داخل المجتمع الطبي. يشير وجود لدونة النسب وعدم التجانس الكبير في سرطان الكبد إلى أن الخلايا السرطانية التي تنشأ من مرضى مختلفين وحتى آفات مميزة داخل نفس المريض قد تظهر سمات جزيئية ومظهرية مختلفة ، مما يمثل عقبات هائلة في تقدم الأساليب العلاجية المبتكرة2،3،4،5. وبالتالي، هناك حاجة ملحة إلى تعزيز فهم الخصائص والآليات البيولوجية لمقاومة الأدوية في سرطان الكبد للاسترشاد بها في صياغة استراتيجيات علاجية أكثر فعالية.
في العقود الأخيرة ، كرس الباحثون جهودهم لتطوير نماذج في المختبر لغرض دراسة HCC 3,4. على الرغم من بعض التطورات ، لا تزال القيود قائمة. تشمل هذه النماذج مجموعة من التقنيات ، مثل استخدام خطوط الخلايا والخلايا الأولية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX). تعمل خطوط الخلايا كنماذج في المختبر لثقافة طويلة الأجل للخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من مرضى سرطان الكبد ، مما يوفر فوائد الراحة والتوسع السهل. تتضمن نماذج الخلايا الأولية العزلة المباشرة وزراعة الخلايا السرطانية الأولية من أنسجة ورم المريض ، مما يوفر تمثيلا للخصائص البيولوجية التي تشبه إلى حد كبير خصائص المرضى أنفسهم. تستلزم نماذج PDX زرع أنسجة ورم المريض في الفئران ، بهدف محاكاة نمو الورم والاستجابة له بأمانة أكبر. كانت هذه النماذج مفيدة في أبحاث سرطان الكبد ، ومع ذلك فهي تمتلك بعض القيود ، بما في ذلك عدم تجانس خطوط الخلايا وعدم القدرة على التكاثر الكامل في ظروف الجسم الحي. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الزراعة المطولة في المختبر إلى تدهور الخصائص والوظائف الأصلية للخلايا ، مما يشكل تحديات في تمثيل الخصائص البيولوجية لسرطان الكبد بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام نماذج PDX يستغرق وقتا طويلا ومكلفا3.
لمعالجة هذه القيود وتكرار السمات الفسيولوجية لسرطان الكبد بشكل أكثر دقة ، تم تقديم استخدام التكنولوجيا العضوية كمنصة بحثية واعدة قادرة على تجاوز القيود السابقة. تتمتع الكائنات العضوية ، وهي نماذج خلايا ثلاثية الأبعاد مستزرعة في المختبر ، بالقدرة على تكرار بنية ووظائف الأعضاء الفعلية. ومع ذلك ، في سياق HCC ، توجد بعض التحديات في إنشاء نماذج عضوية. تشمل هذه التحديات أوصافا مفصلة بشكل غير كاف لإجراءات بناء HCC العضوي ، وعدم وجود بروتوكولات شاملة للعملية الكاملة لبناء الأعضاء HCC ، والحجم الصغير عادة للعضويات المستزرعة6،7،8. في ضوء الأبعاد المحدودة عادة للعضويات المستزرعة ، سعينا لمواجهة هذه التحديات من خلال تطوير بروتوكول شامل يشمل كامل بناء عضوي HCC6. يشمل هذا البروتوكول تفكك الأنسجة ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش. من خلال تحسين الخطوات الإجرائية وتحسين تكوين وسط الاستزراع ، نجحنا في إنشاء نماذج عضوية HCC قادرة على النمو المستدام وتمرير 6,8 على المدى الطويل. في الأقسام اللاحقة ، سيتم تقديم سرد شامل للتعقيدات التشغيلية والعوامل ذات الصلة التي ينطوي عليها بناء عضويات HCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكمن إحدى الفوائد الملحوظة للنماذج العضوية المشتقة من المريض في قدرتها على تكرار الخصائص البيولوجية للأورام بأمانة ، بما في ذلك بنية الأنسجة والمشهد الجينومي. تظهر هذه النماذج مستوى ملحوظا من الدقة وتعكس بشكل فعال عدم تجانس الأورام وتطورها ، حتى على مدى فترات طويلة من الزراعة6</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82122048 ؛ 82003773 ؛ 82203380) ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A1515011416).
Materials
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
