Développement et optimisation d’un modèle organoïde dérivé d’un patient atteint d’un carcinome hépatocellulaire humain pour l’identification de cibles potentielles et la découverte de médicaments

Summary

Nous fournissons une vue d’ensemble complète et affinons les protocoles existants pour la formation d’organoïdes du carcinome hépatocellulaire (CHC), englobant toutes les étapes de la culture des organoïdes. Ce système sert de modèle précieux pour l’identification de cibles thérapeutiques potentielles et l’évaluation de l’efficacité des candidats-médicaments.

Abstract

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur très répandue et mortelle dans le monde entier et sa découverte tardive et l’absence d’agents thérapeutiques spécifiques efficaces nécessitent des recherches supplémentaires sur sa pathogenèse et son traitement. Les organoïdes, un nouveau modèle qui ressemble beaucoup au tissu tumoral natif et qui peut être cultivé in vitro, ont suscité un intérêt considérable ces dernières années, avec de nombreux rapports sur le développement de modèles organoïdes pour le cancer du foie. Dans cette étude, nous avons réussi à optimiser la procédure et à établir un protocole de culture qui permet la formation d’organoïdes de CHC de plus grande taille avec des conditions de passage et de culture stables. Nous avons décrit de manière exhaustive chaque étape de la procédure, couvrant l’ensemble du processus de dissociation des tissus CHC, de placage d’organoïdes, de culture, de passage, de cryoconservation et de réanimation, et fourni des précautions détaillées dans cet article. Ces organoïdes présentent une similitude génétique avec les tissus CHC d’origine et peuvent être utilisés pour diverses applications, y compris l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour les tumeurs et le développement ultérieur de médicaments.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC), une tumeur¹ répandue et très diversifiée, a suscité une attention considérable au sein de la communauté médicale. La présence d’une plasticité de lignée et d’une hétérogénéité substantielle dans le CHC suggère que les cellules tumorales provenant de différents patients et même de lésions distinctes chez le même patient peuvent présenter des traits moléculaires et phénotypiques dissemblables, présentant ainsi des obstacles redoutables à l’avancement d’approches thérapeutiques innovantes 2,3,4,5 . Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les caractéristiques biologiques et les mécanismes de la résistance aux médicaments dans le CHC afin d’éclairer la formulation de stratégies de traitement plus efficaces.

Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont consacré leurs efforts au développement de modèles in vitro dans le but d’étudier le CHC ^3,4. Malgré certaines avancées, des limites persistent. Ces modèles englobent une gamme de techniques, telles que l’utilisation de lignées cellulaires, de cellules primaires et de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Les lignées cellulaires servent de modèles in vitro pour la culture à long terme de cellules tumorales obtenues à partir de patients atteints de CHC, offrant les avantages de la commodité et de la facilité d’expansion. Les modèles cellulaires primaires impliquent l’isolement direct et la culture de cellules tumorales primaires à partir de tissus tumoraux de patients, fournissant ainsi une représentation des caractéristiques biologiques qui ressemblent beaucoup à celles des patients eux-mêmes. Les modèles PDX impliquent la transplantation de tissus tumoraux de patients chez la souris, dans le but de simuler plus fidèlement la croissance et la réponse tumorales. Ces modèles ont joué un rôle déterminant dans la recherche sur le CHC, mais ils présentent certaines limites, notamment l’hétérogénéité des lignées cellulaires et l’incapacité de se répliquer complètement dans des conditions in vivo. De plus, une culture in vitro prolongée peut entraîner une détérioration des caractéristiques et des fonctionnalités d’origine des cellules, ce qui pose des problèmes pour représenter avec précision les propriétés biologiques du CHC. De plus, l’utilisation des modèles PDX est à la fois longue et coûteuse³.

Pour remédier à ces limites et reproduire plus précisément les attributs physiologiques du CHC, l’utilisation de la technologie des organoïdes a été introduite comme une plate-forme de recherche prometteuse capable de dépasser les contraintes précédentes. Les organoïdes, qui sont des modèles cellulaires tridimensionnels cultivés in vitro, ont la capacité de reproduire la structure et la fonctionnalité d’organes réels. Cependant, dans le contexte du CHC, il existe certains défis dans l’établissement de modèles organoïdes. Ces défis comprennent des descriptions insuffisamment détaillées des procédures de construction des organoïdes CHC, l’absence de protocoles complets pour l’ensemble du processus de construction des organoïdes CHC et la petite taille typique des organoïdes cultivés ^6,7,8. À la lumière des dimensions généralement limitées des organoïdes cultivés, nous nous sommes efforcés de relever ces défis par le développement d’un protocole complet englobant l’ensemble de la construction des organoïdes CHC⁶. Ce protocole englobe la dissociation tissulaire, le placage d’organoïdes, la culture, le passage, la cryoconservation et la réanimation. En optimisant les étapes procédurales et en affinant la composition du milieu de culture, nous avons réussi à établir des modèles organoïdes de CHC capables d’une croissance soutenue et d’un passage à long terme ^6,8. Dans les sections suivantes, un compte rendu complet des subtilités opérationnelles et des facteurs pertinents impliqués dans la construction des organoïdes HCC sera présenté.

Protocol

Des tissus biopsiés chez l’homme ont été prélevés sur le patient concerné à l’hôpital et à l’institut de cancérologie affiliés de l’Université médicale de Guangzhou, et le consentement éclairé des patients a été obtenu. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. 1. Établissement d’organoïdes de CHC dérivés de patients à partir d’échantillon…

Representative Results

Lors de la mise en œuvre de la procédure susmentionnée, l’émergence de sphéroïdes organoïdes CHC est généralement observable en l’espace de 3 jours (Figure 1). Les figures 1A et B montrent l’organoïde établi du CHC, qui développe rapidement des sphéroïdes compacts caractérisés par des bords arrondis et un cytosol perméable le premier jour de l’établissement. Au cours de la croissance des organoïdes CHC, l’utilisation…

Discussion

L’un des avantages notables des modèles organoïdes dérivés des patients réside dans leur capacité à reproduire fidèlement les caractéristiques biologiques des tumeurs, englobant la structure tissulaire et le paysage génomique. Ces modèles font preuve d’un niveau de précision remarquable et reflètent efficacement l’hétérogénéité et la progression des tumeurs, même sur de longues périodes de culture ^6,8,9…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines