Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Summary

Wir bieten einen umfassenden Überblick und eine Verfeinerung bestehender Protokolle für die Bildung von Organoiden des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die alle Stadien der Organoidkultivierung umfassen. Dieses System dient als wertvolles Modell für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten.

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein weltweit weit verbreiteter und tödlicher Tumor, dessen späte Entdeckung und das Fehlen wirksamer spezifischer Therapeutika weitere Forschungen zu seiner Pathogenese und Behandlung erforderlich machen. Organoide, ein neuartiges Modell, das nativem Tumorgewebe sehr ähnlich ist und in vitro kultiviert werden kann, haben in den letzten Jahren großes Interesse geweckt, mit zahlreichen Berichten über die Entwicklung von Organoidmodellen für Leberkrebs. In dieser Studie haben wir das Verfahren erfolgreich optimiert und ein Kulturprotokoll etabliert, das die Bildung von größeren HCC-Organoiden mit stabilen Passage- und Kulturbedingungen ermöglicht. Wir haben jeden Schritt des Verfahrens umfassend skizziert und den gesamten Prozess der HCC-Gewebedissoziation, der Organoidplattierung, der Kultur, der Passage, der Kryokonservierung und der Wiederbelebung abgedeckt und in diesem Artikel detaillierte Vorsichtsmaßnahmen getroffen. Diese Organoide weisen eine genetische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen HCC-Gewebe auf und können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele für Tumore und der anschließenden Entwicklung von Medikamenten.

Introduction

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), ein weit verbreiteter und sehr vielfältiger Tumor¹, hat in der medizinischen Fachwelt große Aufmerksamkeit erregt. Das Vorhandensein von Linienplastizität und erheblicher Heterogenität beim HCC deutet darauf hin, dass Tumorzellen, die von verschiedenen Patienten stammen, und sogar unterschiedliche Läsionen innerhalb desselben Patienten unterschiedliche molekulare und phänotypische Merkmale aufweisen können, was die Weiterentwicklung innovativer therapeutischer Ansätze erheblich behindert 2,3,4,5 . Folglich ist es dringend erforderlich, die biologischen Eigenschaften und Mechanismen der Arzneimittelresistenz bei HCC besser zu verstehen, um wirksamere Behandlungsstrategien zu entwickeln.

In den letzten Jahrzehnten haben sich Forscher der Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Untersuchung von HCC ^3,4 gewidmet. Trotz einiger Fortschritte gibt es nach wie vor Einschränkungen. Diese Modelle umfassen eine Reihe von Techniken, wie z. B. die Verwendung von Zelllinien, Primärzellen und patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Zelllinien dienen als In-vitro-Modelle für die Langzeitkultur von Tumorzellen, die von HCC-Patienten gewonnen werden, und bieten die Vorteile der Bequemlichkeit und der einfachen Expansion. Primärzellmodelle beinhalten die direkte Isolierung und Kultur von Primärtumorzellen aus dem Tumorgewebe von Patienten, wodurch eine Darstellung biologischer Merkmale ermöglicht wird, die denen der Patienten selbst sehr ähnlich sind. PDX-Modelle beinhalten die Transplantation von Tumorgewebe von Patienten in Mäuse mit dem Ziel, das Tumorwachstum und -ansprechen genauer zu simulieren. Diese Modelle waren für die HCC-Forschung von entscheidender Bedeutung, weisen jedoch bestimmte Einschränkungen auf, darunter die Heterogenität der Zelllinien und die Unfähigkeit, In-vivo-Bedingungen vollständig zu replizieren. Darüber hinaus kann eine längere In-vitro-Kultivierung zu einer Verschlechterung der ursprünglichen Eigenschaften und Funktionalitäten der Zellen führen, was eine Herausforderung bei der genauen Darstellung der biologischen Eigenschaften von HCC darstellt. Darüber hinaus ist der Einsatz von PDX-Modellen sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig³.

Um diese Einschränkungen zu überwinden und die physiologischen Eigenschaften des HCC genauer zu replizieren, wurde der Einsatz der Organoid-Technologie als vielversprechende Forschungsplattform eingeführt, die in der Lage ist, frühere Einschränkungen zu überwinden. Organoide, bei denen es sich um dreidimensionale Zellmodelle handelt, die in vitro gezüchtet werden, haben die Fähigkeit, die Struktur und Funktionalität tatsächlicher Organe nachzubilden. Im Zusammenhang mit HCC gibt es jedoch gewisse Herausforderungen bei der Etablierung von Organoidmodellen. Zu diesen Herausforderungen gehören unzureichende detaillierte Beschreibungen von HCC-Organoid-Konstruktionsverfahren, das Fehlen umfassender Protokolle für den gesamten Prozess der HCC-Organoid-Konstruktion und die typischerweise geringe Größe kultivierter Organoide ^6,7,8. Angesichts der typischerweise begrenzten Abmessungen von kultivierten Organoiden haben wir uns bemüht, diese Herausforderungen durch die Entwicklung eines umfassenden Protokolls anzugehen, das die gesamte HCC-Organoid-Konstruktion umfasst⁶. Dieses Protokoll umfasst Gewebedissoziation, Organoidplattierung, Kultur, Passage, Kryokonservierung und Wiederbelebung. Durch die Optimierung der Verfahrensschritte und die Verfeinerung der Zusammensetzung des Nährmediums ist es uns gelungen, HCC-Organoidmodelle zu etablieren, die in der Lage sind, nachhaltig zu wachsen und langfristig zu vergehen ^6,8. In den folgenden Abschnitten wird eine umfassende Darstellung der betrieblichen Feinheiten und relevanten Faktoren vorgestellt, die bei der Konstruktion von HCC-Organoiden eine Rolle spielen.

Protocol

Menschliches biopsiertes Gewebe wurde von dem jeweiligen Patienten im angeschlossenen Krebskrankenhaus und Institut der Medizinischen Universität Guangzhou entnommen, und die Patienten erhielten eine informierte Einwilligung. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Etablierung von patienteneigenen HCC-Organoiden aus chirurgischen Proben …

Representative Results

Nach der Implementierung des oben genannten Verfahrens ist die Entstehung von HCC-Organoid-Sphäroiden typischerweise innerhalb einer Zeitspanne von 3 Tagen beobachtbar (Abbildung 1). Die Abbildungen 1A,B zeigen das etablierte HCC-Organoid, das am ersten Tag der Etablierung prompt kompakte Sphäroide entwickelt, die sich durch abgerundete Kanten und durchlässiges Zytosol auszeichnen. Während des Wachstums von HCC-Organoiden hatte die Verwendun…

Discussion

Ein bemerkenswerter Vorteil von patientenabgeleiteten Organoidmodellen liegt in ihrer Fähigkeit, die biologischen Eigenschaften von Tumoren originalgetreu zu replizieren, einschließlich der Gewebestruktur und der genomischen Landschaft. Diese Modelle weisen ein bemerkenswertes Maß an Genauigkeit auf und spiegeln die Heterogenität und Progression von Tumoren wider, selbst über längere Kultivierungszeiträume^{hinweg 6,8,9}. Du…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines