פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד הנגזר מחולה קרצינומה הפטוצלולרית אנושית לזיהוי מטרות פוטנציאליות וגילוי תרופות
Summary
אנו מספקים סקירה מקיפה וחידוד של פרוטוקולים קיימים ליצירת אורגנואידים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), המקיפים את כל שלבי גידול האורגנואידים. מערכת זו משמשת מודל רב ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהערכת יעילות התרופה המועמדת לתרופה.
Abstract
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא גידול נפוץ וקטלני ביותר ברחבי העולם וגילויו המאוחר והיעדר חומרים טיפוליים ספציפיים יעילים מחייבים מחקר נוסף על הפתוגנזה והטיפול בו. אורגנואידים, מודל חדשני הדומה מאוד לרקמת גידול מקומית וניתן לתרבית במבחנה, זכה להתעניינות רבה בשנים האחרונות, עם דיווחים רבים על פיתוח מודלים אורגנואידים לסרטן הכבד. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה מוצלחת של ההליך וביססנו פרוטוקול תרבית המאפשר היווצרות אורגנואידים HCC גדולים יותר עם תנאי מעבר ותרבית יציבים. תיארנו באופן מקיף כל שלב בהליך, המכסה את כל התהליך של דיסוציאציה של רקמות HCC, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה, וסיפקנו אמצעי זהירות מפורטים במאמר זה. אורגנואידים אלה מפגינים דמיון גנטי לרקמות HCC המקוריות וניתן להשתמש בהם ליישומים מגוונים, כולל זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לגידולים ופיתוח תרופות לאחר מכן.
Introduction
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), גידול נפוץ ומגוון1, זכה לתשומת לב רבה בקהילה הרפואית. נוכחותה של פלסטיות שושלת והטרוגניות משמעותית ב-HCC מצביעה על כך שתאי גידול שמקורם בחולים שונים ואף בנגעים מובחנים בתוך אותו מטופל עשויים להפגין תכונות מולקולריות ופנוטיפיות שונות, ובכך להציב מכשולים עצומים בקידום גישות טיפוליות חדשניות 2,3,4,5 . כתוצאה מכך, יש צורך הכרחי בהבנה משופרת של התכונות והמנגנונים הביולוגיים של עמידות לתרופות ב- HCC כדי ליידע את הניסוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.
בעשורים האחרונים, חוקרים הקדישו את מאמציהם לפיתוח מודלים חוץ גופיים לצורך חקר HCC 3,4. למרות התקדמות מסוימת, המגבלות נמשכות. מודלים אלה מקיפים מגוון טכניקות, כגון ניצול קווי תאים, תאים ראשוניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). קווי תאים משמשים כמודלים במבחנה לתרבית ארוכת טווח של תאי גידול המתקבלים מחולי HCC, ומציעים את היתרונות של נוחות והרחבה קלה. מודלים של תאים ראשוניים כוללים בידוד ישיר ותרבית של תאי גידול ראשוניים מרקמות הגידול של המטופל, ובכך מספקים ייצוג של מאפיינים ביולוגיים הדומים מאוד לאלה של החולים עצמם. מודלים של PDX כוללים השתלה של רקמות גידול של חולים בעכברים, במטרה לדמות בצורה נאמנה יותר את צמיחת הגידול ואת תגובתו. מודלים אלה סייעו במחקר HCC, אך יש להם מגבלות מסוימות, כולל ההטרוגניות של קווי תאים וחוסר היכולת לשכפל באופן מלא בתנאי vivo. יתר על כן, גידול מבחנה ממושך עלול לגרום להידרדרות המאפיינים והתפקודים המקוריים של התאים, מה שמציב אתגרים בייצוג מדויק של התכונות הביולוגיות של HCC. בנוסף, השימוש בדגמי PDX גוזל זמן ויקר3.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה ולשכפל בצורה מדויקת יותר את התכונות הפיזיולוגיות של HCC, השימוש בטכנולוגיית אורגנואידים הוצג כפלטפורמת מחקר מבטיחה המסוגלת להתעלות על אילוצים קודמים. לאורגנואידים, שהם מודלים תלת-ממדיים של תאים בתרבית חוץ גופית, יש את היכולת לשכפל את המבנה והפונקציונליות של איברים בפועל. עם זאת, בהקשר של HCC, קיימים אתגרים מסוימים בהקמת מודלים אורגנואידים. אתגרים אלה כוללים תיאורים לא מפורטים מספיק של הליכי בניית אורגנואידים של HCC, היעדר פרוטוקולים מקיפים לכל התהליך של בניית אורגנואידים של HCC, והגודל הקטן בדרך כלל של אורגנואידים בתרבית 6,7,8. לאור הממדים המוגבלים בדרך כלל של אורגנואידים מתורבתים, השתדלנו להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות פיתוח פרוטוקול מקיף המקיף את כל מבנה האורגנואידים של HCC6. פרוטוקול זה כולל דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. על ידי אופטימיזציה של הצעדים הפרוצדורליים ושכלול הרכב מדיום התרבות, ביססנו בהצלחה מודלים אורגנואידים של HCC המסוגלים לצמיחה מתמשכת ומעבר ארוך טווח 6,8. בפרקים הבאים יוצג תיאור מקיף של המורכבויות התפעוליות והגורמים הרלוונטיים המעורבים בבניית אורגנואידים של HCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד היתרונות הבולטים של מודלים אורגנואידים שמקורם במטופל טמון ביכולתם לשכפל נאמנה את המאפיינים הביולוגיים של גידולים, המקיפים את מבנה הרקמה ואת הנוף הגנומי. מודלים אלה מפגינים רמת דיוק יוצאת דופן ומשקפים ביעילות את ההטרוגניות וההתקדמות של גידולים, אפילו לאורך תקופות ממושכות של גידול<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82122048; 82003773; 82203380) וקרן המחקר הבסיסית והיישומית גואנגדונג (2023A1515011416).
Materials
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
