Sviluppo e ottimizzazione di un modello di organoide derivato da pazienti affetti da carcinoma epatocellulare umano per l'identificazione di potenziali bersagli e la scoperta di farmaci

Summary

Forniamo una panoramica completa e un perfezionamento dei protocolli esistenti per la formazione di organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC), comprendendo tutte le fasi della coltivazione degli organoidi. Questo sistema funge da modello prezioso per l’identificazione di potenziali bersagli terapeutici e la valutazione dell’efficacia dei farmaci candidati.

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore altamente diffuso e letale in tutto il mondo e la sua scoperta tardiva e la mancanza di agenti terapeutici specifici efficaci richiedono ulteriori ricerche sulla sua patogenesi e sul suo trattamento. Gli organoidi, un nuovo modello che assomiglia molto al tessuto tumorale nativo e può essere coltivato in vitro, hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, con numerosi rapporti sullo sviluppo di modelli di organoidi per il cancro al fegato. In questo studio, abbiamo ottimizzato con successo la procedura e stabilito un protocollo di coltura che consente la formazione di organoidi HCC di dimensioni maggiori con condizioni stabili di passaggio e coltura. Abbiamo delineato in modo completo ogni fase della procedura, coprendo l’intero processo di dissociazione del tessuto HCC, placcatura di organoidi, coltura, passaging, crioconservazione e rianimazione, e abbiamo fornito precauzioni dettagliate in questo documento. Questi organoidi presentano una somiglianza genetica con i tessuti HCC originali e possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui l’identificazione di potenziali bersagli terapeutici per i tumori e il successivo sviluppo di farmaci.

Introduction

Il carcinoma epatocellulare (HCC), un tumore 1 prevalente e ampiamente^{diversificato, ha} attirato una notevole attenzione all’interno della comunità medica. La presenza di plasticità di lignaggio e di una sostanziale eterogeneità nell’HCC suggerisce che le cellule tumorali originate da vari pazienti e persino lesioni distinte all’interno dello stesso paziente possono manifestare tratti molecolari e fenotipici dissimili, presentando così formidabili ostacoli nell’avanzamento di approcci terapeutici innovativi 2,3,4,5 . Di conseguenza, vi è una necessità imperativa di una migliore comprensione degli attributi biologici e dei meccanismi di resistenza ai farmaci nell’HCC per informare la formulazione di strategie terapeutiche più efficaci.

Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno dedicato i loro sforzi allo sviluppo di modelli in vitro allo scopo di studiare l’HCC ^3,4. Nonostante alcuni progressi, le limitazioni persistono. Questi modelli comprendono una serie di tecniche, come l’utilizzo di linee cellulari, cellule primarie e xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). Le linee cellulari fungono da modelli in vitro per la coltura a lungo termine di cellule tumorali ottenute da pazienti affetti da HCC, offrendo i vantaggi della praticità e della facilità di espansione. I modelli di cellule primarie prevedono l’isolamento diretto e la coltura di cellule tumorali primarie dai tessuti tumorali dei pazienti, fornendo così una rappresentazione delle caratteristiche biologiche che assomigliano molto a quelle dei pazienti stessi. I modelli PDX prevedono il trapianto di tessuti tumorali del paziente nei topi, con l’obiettivo di simulare più fedelmente la crescita e la risposta del tumore. Questi modelli sono stati fondamentali nella ricerca sull’HCC, ma possiedono alcune limitazioni, tra cui l’eterogeneità delle linee cellulari e l’incapacità di replicarsi completamente in condizioni in vivo. Inoltre, la coltivazione prolungata in vitro può comportare il deterioramento delle caratteristiche e delle funzionalità originali delle cellule, ponendo sfide nella rappresentazione accurata delle proprietà biologiche dell’HCC. Inoltre, l’utilizzo dei modelli PDX è dispendioso in termini di tempo e costoso³.

Per affrontare queste limitazioni e replicare in modo più accurato gli attributi fisiologici dell’HCC, l’utilizzo della tecnologia degli organoidi è stata introdotta come una promettente piattaforma di ricerca in grado di superare i vincoli precedenti. Gli organoidi, che sono modelli cellulari tridimensionali coltivati in vitro, hanno la capacità di replicare la struttura e la funzionalità degli organi reali. Tuttavia, nel contesto dell’HCC, esistono alcune sfide nella creazione di modelli di organoidi. Queste sfide includono descrizioni non sufficientemente dettagliate delle procedure di costruzione degli organoidi HCC, la mancanza di protocolli completi per l’intero processo di costruzione degli organoidi HCC e le dimensioni tipicamente ridotte degli organoidi coltivati ^6,7,8. Alla luce delle dimensioni tipicamente limitate degli organoidi coltivati, abbiamo cercato di affrontare queste sfide attraverso lo sviluppo di un protocollo completo che comprenda l’intera costruzione degli organoidi HCC⁶. Questo protocollo comprende la dissociazione tissutale, la placcatura di organoidi, la coltura, il passaging, la crioconservazione e la rianimazione. Ottimizzando le fasi procedurali e perfezionando la composizione del terreno di coltura, abbiamo stabilito con successo modelli di organoidi HCC in grado di crescere e passare a lungo termine ^6,8. Nelle sezioni successive, verrà presentato un resoconto completo delle complessità operative e dei fattori pertinenti coinvolti nella costruzione di organoidi HCC.

Protocol

I tessuti sottoposti a biopsia umana sono stati ottenuti dal rispettivo paziente presso l’Ospedale Oncologico Affiliato e l’Istituto dell’Università di Medicina di Guangzhou ed è stato ottenuto il consenso informato dei pazienti. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. 1. Stabilire organoidi HCC derivati da pazienti da campioni chirurgici NOTA: …

Representative Results

Dopo aver implementato la procedura di cui sopra, l’emergere di sferoidi organoidi HCC è tipicamente osservabile nell’arco di 3 giorni (Figura 1). La Figura 1A,B mostra l’organoide HCC stabilito, che sviluppa prontamente sferoidi compatti caratterizzati da bordi arrotondati e citosol permeabile il primo giorno di stabilimento. Durante la crescita degli organoidi HCC, l’uso di diverse concentrazioni di BME ha avuto effetti diversi sul tasso di c…

Discussion

Un notevole vantaggio dei modelli di organoidi derivati da pazienti risiede nella loro capacità di replicare fedelmente le caratteristiche biologiche dei tumori, comprendendo la struttura dei tessuti e il panorama genomico. Questi modelli dimostrano un notevole livello di accuratezza e rispecchiano efficacemente l’eterogeneità e la progressione dei tumori, anche su lunghi periodi di coltivazione ^6,8,9. Attraverso l’utilizzo di…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines