Разработка и оптимизация модели органоида гепатоцеллюлярной карциномы человека, полученной от пациента, для идентификации потенциальных мишеней и поиска лекарств
Summary
Мы предоставляем всесторонний обзор и уточнение существующих протоколов формирования органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), охватывающих все этапы культивирования органоидов. Эта система служит ценной моделью для идентификации потенциальных терапевтических мишеней и оценки эффективности препаратов-кандидатов.
Abstract
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является широко распространенной и смертельной опухолью во всем мире, и ее позднее обнаружение и отсутствие эффективных специфических терапевтических агентов требуют дальнейших исследований ее патогенеза и лечения. Органоиды, новая модель, которая очень похожа на нативную опухолевую ткань и может быть культивирована in vitro, вызвали значительный интерес в последние годы, с многочисленными сообщениями о разработке органоидных моделей для рака печени. В этом исследовании мы успешно оптимизировали процедуру и разработали протокол культивирования, который позволяет формировать органоиды ГЦК более крупного размера со стабильными условиями пассажа и культивирования. В этой статье мы подробно описали каждый этап процедуры, охватывая весь процесс диссоциации тканей ГЦК, органоидного покрытия, культивирования, пассажа, криоконсервации и реанимации, а также подробно описали меры предосторожности. Эти органоиды демонстрируют генетическое сходство с исходными тканями ГЦК и могут быть использованы для различных применений, включая идентификацию потенциальных терапевтических мишеней для опухолей и последующую разработку лекарств.
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), широко распространенная и широко разнообразная опухоль1, привлекла значительное внимание в медицинском сообществе. Наличие линейной пластичности и существенной гетерогенности в ГЦК позволяет предположить, что опухолевые клетки, происходящие от разных пациентов, и даже различные поражения у одного и того же пациента могут проявлять несхожие молекулярные и фенотипические признаки, тем самым создавая огромные препятствия для продвижения инновационных терапевтических подходов 2,3,4,5 . Следовательно, существует настоятельная необходимость в более глубоком понимании биологических свойств и механизмов лекарственной устойчивости при ГЦК для разработки более эффективных стратегий лечения.
В последние десятилетия исследователи посвятили свои усилия разработке моделей in vitro с целью изучения ГЦК 3,4. Несмотря на некоторые достижения, ограничения сохраняются. Эти модели охватывают целый ряд методов, таких как использование клеточных линий, первичных клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Клеточные линии служат моделями in vitro для долгосрочного культивирования опухолевых клеток, полученных от пациентов с ГЦК, предлагая преимущества удобства и легкого расширения. Модели первичных клеток предполагают прямое выделение и культивирование первичных опухолевых клеток из опухолевых тканей пациента, тем самым обеспечивая представление биологических характеристик, которые очень похожи на характеристики самих пациентов. PDX-модели предполагают трансплантацию опухолевых тканей пациента мышам с целью более точного моделирования роста опухоли и ответной реакции. Эти модели сыграли важную роль в исследованиях ГЦК, но они обладают определенными ограничениями, включая гетерогенность клеточных линий и неспособность полностью реплицироваться в условиях in vivo. Кроме того, длительное культивирование in vitro может привести к ухудшению исходных характеристик и функциональности клеток, что создает проблемы с точным представлением биологических свойств ГЦК. Кроме того, использование моделей PDX отнимает много времени и средств3.
Для устранения этих ограничений и более точного воспроизведения физиологических свойств ГЦК было введено использование органоидной технологии в качестве перспективной исследовательской платформы, способной превзойти предыдущие ограничения. Органоиды, которые представляют собой трехмерные клеточные модели, культивируемые in vitro, обладают способностью воспроизводить структуру и функциональность реальных органов. Тем не менее, в контексте ГЦК существуют определенные проблемы в создании органоидных моделей. Эти проблемы включают в себя недостаточно подробное описание процедур конструирования органоидов ГЦК, отсутствие всеобъемлющих протоколов для всего процесса конструирования органоидов ГЦК и, как правило, небольшой размер культивируемых органоидов 6,7,8. В свете обычно ограниченных размеров культивируемых органоидов мы попытались решить эти проблемы путем разработки всеобъемлющего протокола, охватывающего всю конструкцию органоида ГЦК6. Этот протокол включает в себя диссоциацию тканей, органоидное покрытие, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Оптимизировав технологические этапы и уточнив состав питательной среды, мы успешно создали модели органоидов ГЦК, способные к устойчивому росту и длительному пассажу 6,8. В последующих разделах будет представлен всесторонний отчет об эксплуатационных тонкостях и соответствующих факторах, участвующих в построении органоидов ГЦК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из заметных преимуществ органоидных моделей, полученных от пациентов, является их способность точно воспроизводить биологические характеристики опухолей, охватывая структуру тканей и геномный ландшафт. Эти модели демонстрируют выдающийся уровень точности и эффективно отража?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование выполнено при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82122048; 82003773; 82203380) и Фонда фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2023A1515011416).
Materials
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
