Utveckling och optimering av en patienthärledd organoidmodell för humant hepatocellulärt karcinom för potentiell målidentifiering och läkemedelsupptäckt

Summary

Vi tillhandahåller en omfattande översikt och förfining av befintliga protokoll för organoidbildning av hepatocellulärt karcinom (HCC), som omfattar alla stadier av organoidodling. Detta system fungerar som en värdefull modell för identifiering av potentiella terapeutiska mål och bedömning av läkemedelskandidaters effektivitet.

Abstract

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en mycket utbredd och dödlig tumör över hela världen och dess sena upptäckt och brist på effektiva specifika terapeutiska medel kräver ytterligare forskning om dess patogenes och behandling. Organoider, en ny modell som liknar naturlig tumörvävnad och kan odlas in vitro, har väckt stort intresse de senaste åren, med många rapporter om utvecklingen av organoidmodeller för levercancer. I denna studie har vi framgångsrikt optimerat proceduren och etablerat ett odlingsprotokoll som möjliggör bildandet av större HCC-organoider med stabila passage- och odlingsförhållanden. Vi har utförligt beskrivit varje steg i proceduren, som täcker hela processen med HCC-vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning, och tillhandahållit detaljerade försiktighetsåtgärder i detta dokument. Dessa organoider uppvisar genetisk likhet med de ursprungliga HCC-vävnaderna och kan användas för olika tillämpningar, inklusive identifiering av potentiella terapeutiska mål för tumörer och efterföljande läkemedelsutveckling.

Introduction

Hepatocellulärt karcinom (HCC), en utbredd och mycket varierad tumör¹, har fått stor uppmärksamhet inom det medicinska samfundet. Förekomsten av härstamningsplasticitet och betydande heterogenitet i HCC tyder på att tumörceller som härrör från olika patienter och till och med distinkta lesioner inom samma patient kan uppvisa olika molekylära och fenotypiska egenskaper, vilket utgör formidabla hinder för utvecklingen av innovativa terapeutiska metoder 2,3,4,5 . Följaktligen finns det ett absolut behov av ökad förståelse av de biologiska egenskaperna och mekanismerna för läkemedelsresistens vid HCC för att informera formuleringen av mer effektiva behandlingsstrategier.

Under de senaste decennierna har forskare ägnat sina ansträngningar åt att utveckla in vitro-modeller i syfte att studera HCC ^3,4. Trots vissa framsteg kvarstår begränsningarna. Dessa modeller omfattar en rad olika tekniker, såsom användning av cellinjer, primära celler och patient-deriverade xenografter (PDX). Cellinjer fungerar som in vitro-modeller för långtidsodling av tumörceller erhållna från HCC-patienter, vilket ger fördelarna med bekvämlighet och enkel expansion. Primära cellmodeller innebär direkt isolering och odling av primära tumörceller från patientens tumörvävnad, vilket ger en representation av biologiska egenskaper som liknar patienterna själva. PDX-modeller innebär transplantation av tumörvävnad från patienter till möss, i syfte att mer exakt simulera tumörtillväxt och respons. Dessa modeller har varit avgörande för HCC-forskning, men de har vissa begränsningar, inklusive cellinjernas heterogenitet och oförmågan att fullt ut replikera in vivo-förhållanden. Dessutom kan långvarig in vitro-odling leda till försämring av cellernas ursprungliga egenskaper och funktioner, vilket innebär utmaningar när det gäller att korrekt representera de biologiska egenskaperna hos HCC. Dessutom är användningen av PDX-modeller både tidskrävande och kostsam³.

För att ta itu med dessa begränsningar och mer exakt replikera de fysiologiska egenskaperna hos HCC har användningen av organoidteknik introducerats som en lovande forskningsplattform som kan överträffa tidigare begränsningar. Organoider, som är tredimensionella cellmodeller odlade in vitro, har förmågan att replikera strukturen och funktionaliteten hos faktiska organ. I samband med HCC finns det dock vissa utmaningar med att etablera organoidmodeller. Dessa utmaningar inkluderar otillräckligt detaljerade beskrivningar av HCC-organoidkonstruktionsprocedurer, brist på omfattande protokoll för hela processen för HCC-organoidkonstruktion och den vanligtvis lilla storleken på odlade organoider ^6,7,8. Mot bakgrund av de vanligtvis begränsade dimensionerna av odlade organoider, strävade vi efter att ta itu med dessa utmaningar genom att utveckla ett omfattande protokoll som omfattar hela HCC-organoidkonstruktion⁶. Detta protokoll omfattar vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning. Genom att optimera procedurstegen och förfina sammansättningen av odlingsmediet har vi framgångsrikt etablerat HCC-organoidmodeller som kan upprätthålla tillväxt och långsiktig passage ^6,8. I de följande avsnitten kommer en omfattande redogörelse för de operativa krångligheterna och relevanta faktorer som är involverade i konstruktionen av HCC-organoider att presenteras.

Protocol

Vävnader från humana biopsier erhölls från respektive patient vid Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, och informerat samtycke erhölls från patienterna. Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll. 1. Etablering av HCC-organoider från patienter från kirurgiska prover OBS: Etableringen av HCC-organoider omfattar olika steg, näm…

Representative Results

Vid implementering av ovannämnda procedur kan uppkomsten av HCC-organoidsfäroider vanligtvis observeras inom ett intervall av 3 dagar (Figur 1). Figur 1A,B visar den etablerade HCC-organoiden, som snabbt utvecklar kompakta sfäroider som kännetecknas av rundade kanter och permeabel cytosol på den första etableringsdagen. Under tillväxten av HCC-organoider hade användningen av olika koncentrationer av BME olika effekter på organoidernas t…

Discussion

En anmärkningsvärd fördel med patienthärledda organoidmodeller ligger i deras förmåga att troget replikera de biologiska egenskaperna hos tumörer, vilket omfattar vävnadsstruktur och genomiskt landskap. Dessa modeller uppvisar en anmärkningsvärd nivå av noggrannhet och speglar effektivt heterogeniteten och progressionen av tumörer, även under längre perioder av odling ^6,8,9. Genom att använda detta förfinade orga…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines