Komplementære tilgange til at forhøre mitofagiflux i β-celler i bugspytkirtlen
Summary
Denne protokol skitserer to metoder til kvantitativ analyse af mitofagia i bugspytkirtlen β-celler: for det første en kombination af cellegennemtrængelige mitokondriespecifikke farvestoffer og for det andet en genetisk kodet mitofagireporter. Disse to teknikker supplerer hinanden og kan anvendes baseret på specifikke behov, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og præcision i kvantitativ håndtering af mitokondriel kvalitetskontrol.
Abstract
Mitofagi er en kvalitetskontrolmekanisme, der er nødvendig for at opretholde optimal mitokondriefunktion. Dysfunktionel β-celle mitofagi, resulterer i utilstrækkelig insulinfrigivelse. Avancerede kvantitative vurderinger af mitofagi, kræver ofte brug af genetiske reportere. mt-Keima-musemodellen, der udtrykker en mitokondrie-målrettet pH-følsom dual-excitation ratiometrisk sonde til kvantificering af mitofagien via flowcytometri, er blevet optimeret i β-celler. Forholdet mellem sure og neutrale mt-Keima-bølgelængdeemissioner kan bruges til robust kvantificering af mitofagi. Brug af genetiske mitofagireportere kan dog være udfordrende, når man arbejder med komplekse genetiske musemodeller eller celler, der er vanskelige at transfektere, såsom primære menneskelige øer. Denne protokol beskriver en ny komplementær farvestofbaseret metode til kvantificering af β-celle mitofagi, i primære øer ved hjælp af MtPhagy. MtPhagy er et pH-følsomt, cellegennemtrængeligt farvestof, der akkumuleres i mitokondrierne og øger dets fluorescensintensitet, når mitokondrier er i miljøer med lav pH, såsom lysosomer under mitofagi. Ved at kombinere MtPhagy-farvestoffet med Fluozin-3-AM, en Zn2+ -indikator, der vælger β-celler, og tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE) til vurdering af mitokondriemembranpotentiale, kan mitofagiflux kvantificeres specifikt i β-celler via flowcytometri. Disse to tilgange er meget komplementære, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og præcision i vurderingen af mitokondriel kvalitetskontrol i adskillige β-cellemodeller.
Introduction
Pancreas β-celler producerer og udskiller insulin for at imødekomme metaboliske krav, og β-celle dysfunktion er ansvarlig for hyperglykæmi og diabetes debut i både type 1 og type 2 diabetes. β-celler kobler glukosemetabolisme med insulinsekretion via mitokondriel energetik og metabolisk output, som afhænger af en reserve af funktionel mitokondriemasse 1,2,3. For at opretholde optimal β-cellefunktion er β-celler afhængige af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer for at fjerne gamle eller beskadigede mitokondrier og bevare funktionel mitokondriemasse4. Selektiv mitokondriel autofagi, også kendt som mitofagi, er en nøglekomponent i mitokondriekvalitetskontrolvejen.
Vurderinger af mitofagi, i levende celler, er ofte afhængige af ændringer i mitokondriel pH, der opstår under mitofagi. Mitokondrier har en let alkalisk pH, og sunde mitokondrier befinder sig normalt i den pH-neutrale cytosol. Under mitofagi, beskadigede eller dysfunktionelle mitokondrier er selektivt indarbejdet i autofagosomer og til sidst ryddet inden for sure lysosomer5. Flere in vivo transgene mitofagi-reportermusemodeller, såsom mt-Keima6, mitoQC7 og CMMR8, samt transfektable mitofagiprober, såsom Cox8-EGFP-mCherry-plasmid9, bruger denne pH-ændring til at give kvantitative vurderinger af mitofagi. Anvendelse af transgene mus, der udtrykker mt-Keima pH-følsom dual-excitation ratiometrisk sonde, er blevet optimeret til mitofagi-vurderinger i øer og β-celler via flowcytometri10,11. Forholdet mellem sure og neutrale mt-Keima-bølgelængdeemissioner (forholdet mellem sur 561 nm og neutral 480 nm excitation) kan bruges til robust kvantificering af mitofagien 6,12.
Denne protokol beskriver en optimeret tilgang til vurdering af mitofagiflux i primære øer og β-celler isoleret fra mt-Keima transgene mus10,11. Mens mt-Keima er en meget følsom sonde, kræver den enten komplicerede dyreavlsordninger eller transfektion af celler, hvilket ofte kan være udfordrende, når man arbejder i kombination med andre genetiske modeller eller med primære menneskelige øer. Derudover kan brugen af flere fluorescenslasere og detektorer til at identificere neutrale og sure cellepopulationer begrænse den kombinatoriske brug af andre fluorescerende reportere.
For at overvinde disse udfordringer beskriver denne protokol også en komplementær, enkelt fluorescerende kanal, farvestofbaseret metode til robust påvisning af mitofagi, i β-celler fra isolerede museøer. Denne tilgang, kaldet Mtfagy-metoden, anvender en kombination af tre cellegennemtrængelige farvestoffer til at vælge β-celler, kvantificere cellepopulationerne, der aktivt gennemgår mitofagi, og vurdere mitokondriemembranpotentiale (MMP eller Δψm) samtidigt.
Det første af disse farvestoffer er Fluozin-3-AM, en cellegennemtrængelig Zn2+ indikator med en Ex/Em 494/516 nm13. Museøer omfatter en heterogen population af funktionelt forskellige celler, herunder α-, β-, δ- og PP-celler. β-celler udgør ca. 80% af cellerne i museøen og kan skelnes fra andre øcelletyper på grund af deres høje Zn2+ koncentration inden for insulingranulat14,15, hvilket muliggør identifikation af β-celler som Fluozin-3-AMhøj population. MtPhagy-farvestoffet, et pH-følsomt farvestof, der immobiliseres på mitokondrier via en kemisk binding og udsender svag fluorescens, anvendes også i denne protokol16. Ved mitofaginduktion inkorporeres beskadigede mitokondrier i det sure lysosom, og Mtfagy-farvestoffet øger dets fluorescensintensitet inden for det lave pH-miljø (Ex/Em 561/570-700 nm).
Derudover anvendes tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE), til vurdering af MMP. TMRE er et cellegennemtrængeligt positivt ladet farvestof (Ex/Em 552/575 nm), der bindes af sunde mitokondrier på grund af den relative negative ladning, der opretholdes af deres membranpotentiale17. Beskadigede eller usunde mitokondrier spreder deres membranpotentiale, hvilket resulterer i nedsat evne til at sekvestre TMRE. Ved hjælp af disse farvestoffer sammen kan β-celler, der gennemgår mitofagi, identificeres som FluozinhøjMtPhagyhøjTMRElav befolkning via flowcytometri. Da mitofagien er en dynamisk snarere end statisk proces, blev denne protokol optimeret til at vurdere mitofagiflux ved anvendelse af valinomycin, en K +-ionofor, der inducerer mitofagi, efter spredning af MMP18. Sammenligning af mitofagi, i nærvær og fravær af valinomycin, muliggør vurdering af mitofagiflux i forskellige prøvegrupper.
Den farvestofbaserede karakter af den nuværende tilgang gør det muligt at ekstrapolere den til menneskelige øer og andre vanskeligt transfekterede celletyper og omgår behovet for komplicerede dyreavlsordninger, i modsætning til mt-Keima-protokollen. Det overordnede mål med denne protokol er at kvantificere mitofagien i β-celler på enkeltcelleniveau via to uafhængige flowcytometribaserede metoder. Samlet set beskriver denne protokol to kraftfulde og komplementære metoder, der giver mulighed for både præcision og fleksibilitet i den kvantitative undersøgelse af mitokondriel kvalitetskontrol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskrev to komplementære metoder til kvantificering af mitofagiflux i dissocierede primære museøer. Ved hjælp af mt-Keima-metoden blev en stigning i mitofagien kvantificeret som et øget forhold mellem sure (561 nm) / neutrale (405 nm) celler, mens i MtFagy-metoden blev øget mitofagiflux kvantificeret som en stigning i FluozinhøjMtPhagyhøjTMRElavcellepopulation . Disse metoder giver mulighed for hurtige, kvantitative og β-cellespecifikke vurderinger af mitofagiflux….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. anerkender støtte fra NIH (T32-AI007413 og T32-AG000114). SAS anerkender støtte fra JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), Brehm-familien og Anthony-familien.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
