अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स से पूछताछ करने के लिए पूरक दृष्टिकोण
Summary
यह प्रोटोकॉल अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए दो तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है: पहला, सेल-पारगम्य माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट रंगों का संयोजन, और दूसरा, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड माइटोफैगी रिपोर्टर। ये दो तकनीकें पूरक हैं और विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर तैनात की जा सकती हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण को मात्रात्मक रूप से संबोधित करने में लचीलापन और सटीकता की अनुमति मिलती है।
Abstract
माइटोफैगी एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है जो इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। डिसफंक्शनल β-सेल माइटोफैगी के परिणामस्वरूप अपर्याप्त इंसुलिन रिलीज होता है। माइटोफैगी के उन्नत मात्रात्मक आकलन के लिए अक्सर आनुवंशिक पत्रकारों के उपयोग की आवश्यकता होती है। एमटी-कीमा माउस मॉडल, जो प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त करता है, को β-कोशिकाओं में अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ mt-Keima तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के अनुपात का उपयोग माइटोफैगी को मजबूती से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जटिल आनुवंशिक माउस मॉडल या मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, जैसे प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ काम करते समय आनुवंशिक माइटोफैगी पत्रकारों का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल MtPhagy का उपयोग करके प्राथमिक आइलेट्स में β-सेल माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास पूरक डाई-आधारित विधि का वर्णन करता है। MtPhagy एक पीएच-संवेदनशील, सेल-पारगम्य डाई है जो माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होती है और इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है जब माइटोकॉन्ड्रिया कम पीएच वातावरण में होते हैं, जैसे कि माइटोफैगी के दौरान लाइसोसोम। Fluozin-3-AM के साथ MtPhagy डाई के संयोजन से, एक Zn2+ संकेतक जो β-कोशिकाओं के लिए चयन करता है, और टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (TMRE) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए, माइटोफैगी फ्लक्स को विशेष रूप से प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से β-कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। ये दो दृष्टिकोण अत्यधिक पूरक हैं, जो कई β-सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन करने में लचीलेपन और सटीकता की अनुमति देते हैं।
Introduction
अग्नाशयी β-कोशिकाएं चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए इंसुलिन का उत्पादन और स्राव करती हैं, और β-सेल डिसफंक्शन टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों में हाइपरग्लाइसेमिया और मधुमेह की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है। β-कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान और चयापचय उत्पादन के माध्यम से इंसुलिन स्राव के साथ ग्लूकोज चयापचय को जोड़ती हैं, जो कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान 1,2,3 के रिजर्व पर निर्भर करती हैं। इष्टतम β-सेल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए, β-कोशिकाएं वृद्ध या क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमानको संरक्षित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर भरोसा करती हैं। चयनात्मक माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी, जिसे माइटोफैगी के रूप में भी जाना जाता है, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग का एक प्रमुख घटक है।
जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी का आकलन अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल पीएच में परिवर्तन पर निर्भर करता है जो माइटोफैगी के दौरान होता है। माइटोकॉन्ड्रिया में थोड़ा क्षारीय पीएच होता है, और स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य रूप से पीएच-तटस्थ साइटोसोल में रहते हैं। माइटोफैगी के दौरान, क्षतिग्रस्त या शिथिल माइटोकॉन्ड्रिया को चुनिंदा रूप से ऑटोफैगोसोम में शामिल किया जाता है और अंततः अम्लीय लाइसोसोमके भीतर साफ किया जाता है। विवो ट्रांसजेनिक माइटोफैगी रिपोर्टर माउस मॉडल में कई, जैसे एमटी-कीमा6, माइटोक्यूसी7, और सीएमएमआर8, साथ ही ट्रांसफेक्टेबल माइटोफैगी जांच, जैसे कि कॉक्स 8-ईजीएफपी-एमचेरी प्लास्मिड9, माइटोफैगी के मात्रात्मक आकलन प्रदान करने के लिए इस पीएच परिवर्तन का उपयोग करते हैं। एमटी-कीमा पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री10,11के माध्यम से आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी आकलन के लिए अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ एमटी-कीमा तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन (अम्लीय 561 एनएम से तटस्थ 480 एनएम उत्तेजना का अनुपात) का अनुपात माइटोफैगी 6,12 को मजबूती से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल प्राथमिक आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो एमटी-कीमा ट्रांसजेनिक चूहों 10,11से अलग है। जबकि एमटी-कीमा एक अत्यधिक संवेदनशील जांच है, इसके लिए या तो जटिल पशु प्रजनन योजनाओं या कोशिकाओं के अभिकर्मक की आवश्यकता होती है, जो अक्सर अन्य आनुवंशिक मॉडल या प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ संयोजन में काम करते समय चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, तटस्थ और अम्लीय सेल आबादी की पहचान करने के लिए कई प्रतिदीप्ति लेज़रों और डिटेक्टरों का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट पत्रकारों के दहनशील उपयोग को सीमित कर सकता है।
इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, इस प्रोटोकॉल भी एक पूरक, एकल फ्लोरोसेंट चैनल, अलग माउस आइलेट्स से β कोशिकाओं में mitophagy के मजबूत पता लगाने के लिए डाई आधारित विधि का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण, जिसे MtPhagy विधि के रूप में संदर्भित किया जाता है, β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए तीन सेल-पारगम्य रंगों के संयोजन का उपयोग करता है, सक्रिय रूप से माइटोफैगी से गुजरने वाली सेल आबादी की मात्रा निर्धारित करता है, और एक साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (MMP या Δψm) का आकलन करता है।
इन रंगों में से पहला फ्लोज़िन-3-एएम है, जो एक सेल-पारगम्य Zn2+ संकेतक है जिसमें Ex/Em 494/516 nm13 है। माउस आइलेट्स में कार्यात्मक रूप से अलग-अलग कोशिकाओं की एक विषम आबादी शामिल है, जिसमें α-, β-, δ- और पीपी कोशिकाएं शामिल हैं। β-कोशिकाओं माउस आइलेट के भीतर कोशिकाओं के लगभग 80% शामिल हैं और इंसुलिन कणिकाओं14,15 के भीतर उनके उच्च Zn2+ एकाग्रता के कारण अन्य आइलेट सेल प्रकार से अलग किया जा सकता है, Fluozin-3 AMउच्च आबादी के रूप में β कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है. MtPhagy डाई, एक पीएच संवेदनशील डाई है कि एक रासायनिक बंधन के माध्यम से mitochondria पर immobilized है और कमजोर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, भी इस प्रोटोकॉल16 में प्रयोग किया जाता है. माइटोफैगी प्रेरण पर, क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को अम्लीय लाइसोसोम में शामिल किया जाता है, और MtPhagy डाई कम पीएच वातावरण (Ex/Em 561/570-700 nm) के भीतर इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाती है।
इसके अतिरिक्त, टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (टीएमआरई), का उपयोग एमएमपी का आकलन करने के लिए किया जाता है। टीएमआरई एक सेल-पारगम्य सकारात्मक चार्ज डाई (पूर्व / ईएम 552/575 एनएम) है जो स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अनुक्रमित है क्योंकि उनके झिल्ली क्षमता17 द्वारा बनाए गए सापेक्ष नकारात्मक चार्ज के कारण। क्षतिग्रस्त या अस्वास्थ्यकर माइटोकॉन्ड्रिया उनकी झिल्ली क्षमता को नष्ट कर देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप टीएमआरई को अनुक्रमित करने की क्षमता कम हो जाती है। इन रंगों का एक साथ उपयोग करते हुए, माइटोफैगी से गुजरने वाली β-कोशिकाओं को फ्लोटिन साइटोमेट्री के माध्यम से फ्लुओज़िनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम आबादी के रूप में पहचाना जा सकता है। चूंकि माइटोफैगी स्थैतिक प्रक्रिया के बजाय एक गतिशील है, इसलिए इस प्रोटोकॉल को वैलिनोमाइसिन का उपयोग करके माइटोफैगी फ्लक्स का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया गया था, एक के +-आयनोफोर जो एमएमपी18 के अपव्यय के बाद माइटोफैगी को प्रेरित करता है। वैलिनोमाइसिन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइटोफैगी की तुलना विभिन्न नमूना समूहों में माइटोफैगी प्रवाह के आकलन की अनुमति देती है।
वर्तमान दृष्टिकोण की डाई-आधारित प्रकृति इसे मानव आइलेट्स और अन्य कठिन-से-ट्रांसफ़ेक्ट सेल प्रकारों के लिए एक्सट्रपलेशन करने की अनुमति देती है और एमटी-कीमा प्रोटोकॉल के विपरीत, जटिल पशु प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता को दरकिनार करती है। इस प्रोटोकॉल का व्यापक लक्ष्य दो स्वतंत्र प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधियों के माध्यम से एकल-कोशिका स्तर पर β-कोशिकाओं में माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करना है। एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल दो शक्तिशाली और पूरक तरीकों है कि दोनों परिशुद्धता और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण के मात्रात्मक अध्ययन में लचीलापन के लिए अनुमति का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ने अलग-अलग प्राथमिक माउस आइलेट्स में माइटोफैगी प्रवाह की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो पूरक तरीकों का वर्णन किया। एमटी-कीमा विधि का उपयोग करते हुए, माइटोफैगी में वृद्धि को अम्लीय (561 एनए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ई.एल.डी. एनआईएच (टी 32-AI007413 और टी 32-AG000114) से समर्थन स्वीकार करता है। SAS JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), वयोवृद्ध मामलों के विभाग (I01 BX004444), ब्रेहम परिवार और एंथोनी परिवार से समर्थन स्वीकार करता है।
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
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